环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制.docVIP

PAGE PAGE 17 项目名称： 环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制 一、研究内容 拟解决的关键科学问题 精子异常是男性不育和父源性出生缺陷发生的主要原因。阐明环境EDCs、遗传因子改变致精子异常的分子机制和机体对EDCs易感性差异的分子基础，揭示男性不育和出生缺陷的复杂病因及其发病机制是本项研究的关键科学问题。其中包括： 1. 代表性EDCs通过何种分子机制影响下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程的不同环节，从而引起精子异常的各类表型？ 2. 遗传因子如染色体重组交换和联会改变引起精子发生停滞或染色体异常的分子机制和调控机理是什么？ 3. 环境-基因交互作用导致男性不育的作用模式和机制是什么？ 4. 精子异常导致常见出生缺陷如染色体病和先天性心脏病发生的机制是什么？ 主要研究内容 1．环境因素导致精子异常的分子机制 1.1代表性EDCs的代谢特征及其与精子异常的关系 通过体内和体外研究代表性EDCs的代谢特征，阐明EDCs内暴露与精子异常的关联，寻找接触性生物标志物。从我国目前环境污染的现状出发，并结合项目组多年的研究基础，遵循“有所为、有所不为”的原则，拟选择邻苯二甲酸酯类、烷基酚类/双酚系化合物、农药杀虫剂类、多环芳烃类、多溴联苯醚类、全氟代烃类和重金属类共七类为目标EDCs。首先通过体外代谢特征和内分泌干扰活性分析并结合动物染毒模型，初步筛选出关键的EDCs因子；然后围绕这些关键EDCs，收集男性不育（精子异常）和职业暴露人群和正常男性对照病例，采集流行病学信息和精液、血液、尿液生物样本，分析EDCs内暴露水平和男性生殖内分泌功能，评价EDCs及其代谢与男性不育（精子异常）的相关性。 运用动物染毒模型结合基因芯片技术筛选与EDCs有关的代谢酶基因，利用酶反应学、细胞生物学和质谱分析技术，鉴定代表性EDCs的关键代谢酶、代谢特征，初步确定候选代谢产物。利用受体报告基因系统，甄别候选代谢产物的雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、甲状腺激素/抗甲状腺激素活性，初步明确代表性EDCs代谢产物的内分泌干扰活性。运用动物模型研究代表性EDCs候选代谢产物与精子异常的关系，初步确认相关EDCs特征性代谢产物；应用高效液相 色谱等方法，分析病例和对照人群生物样本中EDCs的代谢产物水平及与男性精子异常的相关性，筛选出代表性EDCs的接触性生物标志物。运用代谢组学的研究思路，应用UPLC-Q-TOF等方法针对精子异常不同表型和对照的生物样本进行代谢产物谱分析，结合主成分分析等数据分析平台进行分析，进一步验证和确定上述生物标志物。 1.2 代表性EDCs致精子发生异常的分子靶标 通过系统研究代表性EDCs对下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程不同环节的影响，初步阐明代表性EDCs对雄性生殖损害的靶点和分子途径。 采用针对不同发育阶段小鼠下丘脑-垂体-睾丸轴定点染毒的方法，观察染毒位点下游靶细胞的变化，分析相应激素的分泌和相关基因的表达，确定EDCs损伤下丘脑-垂体-睾丸轴的作用位点。重点关注代表性EDCs通过下丘脑-垂体-睾丸轴影响精子发生的微环境激素调控作用及方式，特别是支持细胞、间质细胞对精子细胞的影响及它们的相互作用。运用基因组学、蛋白组学、miRNA基因芯片技术构建正常小鼠和染毒小鼠精子发生不同阶段睾丸基因、蛋白质和miRNA表达谱，通过比对获得差异表达基因、蛋白质和miRNA，作为EDCs导致精子发生障碍的侯选作用靶分子，对部分差异基因、蛋白质和miRNA进行功能研究，阐明EDCs的作用机制。同时，采用生物信息学技术对所获得差异表达基因及其编码蛋白进行整合分析，发现EDCs导致精子发生障碍的新的作用通路，试图找到关键性的分子标记物。然后，运用RNA干扰和基因敲除技术，建立标志性分子的缺陷小鼠动物模型和细胞模型，验证上述标志性分子对精子发生的影响。 2．遗传因素导致精子异常的调控机理 2.1 减数分裂重组交换异常致精子发生异常的分子机制 MLH1是重组交换过程中的关键蛋白，研究MLH1在精子发生中的确切作用和分子机制，以阐明重组交换异常导致不育和非整倍体形成的分子机理，为不育的个性化诊断提供新的依据。 分别获取人类正常、无精、有染色体分离错误的严重寡精症患者的睾丸活检组织，运用免疫荧光细胞遗传学等方法对MLH1的数目、位置及调控(如位点干涉)、重组交换相关的重要事件(如同源染色体配对、联会)和减数分裂停滞、染色体分离错误之间的关系进行关联度的研究。并同时探讨影响MLH1分布的因素如年龄、甲基化、miRNA、染色体端粒(长度和端粒酶活性)等。运用免疫荧光细胞遗传学研究已知的重组交换相关蛋白(如RAD51/DMC1等)的时空表达模式和与MLH1共定位情况。运用酵母双杂交或免疫共沉淀筛选出与ML