基因重组与基因工程技术课件.ppt

依据：碱基互补配对原则 步骤： ①合成核酸探针（与所需基因互补的核苷酸短链，并用同位素标记） ②升高温度或改变pH使DNA变性 ③分子杂交（常用原位分子杂交）如果基因文库中的一个DNA片段能和探针结合形成双链，这一片段即含有所需基因。 分子杂交 免疫化学检测法 滤膜（固定抗体） + DNA序列分析法 该方法通常是用在目的基因筛选后最终的鉴定。 ACTGAAGGCT 真核细胞的筛选 新霉素抗性选择系统： 新霉素是原核生物的抗生素，对真核生物没有抑制作用，但新霉素的类似物G418对真核细胞及原核细胞均具有抑制作用。新霉素抗性基因（neo）能在真核细胞中表达并能使G418失活（neo基因编码一个磷酸转移酶），细胞可以生长。 真核细胞的筛选标记 新霉素类药物 G418筛选 Am Neo P ori G418 灭活 （-） 蛋白质合成 tk- 细胞突变株筛选转染细胞 选择原理： tk(胸苷激酶)基因的筛选：受体细胞必须是相应的tk-，将细胞培养在含HAT（H：黄嘌呤，A：氨甲喋呤，T：胸苷）的培养基中。在A存在下，核苷酸的从头合成途径被阻断，不能合成AMP、TMP及GMP。这三种核苷酸的合成只能有补偿途径合成，必须具有tk基因的存在细胞才可生长。 氨基喋呤筛选法 氨基喋呤 (HAT选择) 核酸从头合成 （-） 核酸补救合成（TK酶）