抗肺癌单链抗体偶联绿色荧光蛋白基因的构建及表达研究-生物物理学专业毕业论文.docxVIP

降夕亭Z乎 降夕亭Z乎 ⑧ 硕士学位论文 摘 要 绿色荧光蛋囱作为一种新型l}勺标记分子，可威用于活体细胞的实时检测。目 前已有相当多的文献报道关于将GFP基因与特定抗体或细胞园子纂因结合进行融 合表达的研究，诞明融合蛋白具商GFP的荧光性质和配体骚自质的生物功能，可 用于对肿瘤的检测、药物筛选、细胞因子受体的分布以及功能等方面的研究，应 翔蔻景广滔。 目前闺内关于将绿色荧光蛋囱与其他细胞因予融合表逖的报道较少。相关的 援遘畜抗释癌单链抗体融台GFP在粪核籀貔孛懿表达，殴爱重缝lL—18一G静融合蛋 囱活性研究等。本论文拟将抗肺揍单链抗体连接绿色荧光蛋白进行融合表达，预 黼目标蚤白应同时其有抗体活性殿光激发绿色荧光双重功缱。 本实验经PCR方法从mRNA逆转袋产物中克隆到抗肺癌抗体的熏链可变 隧和轻键可变区，并利用重叠延伸PCR方法将翼构建为举链抗体scfv形式。利 遐酶甥逑接将sc＆基因痒列插入翱绿色荧光蛋白基因3’．壤均成g国．se钾震组基 因，并转化太肠杆菌表达。经碑TG诱导袭达后并SDs．PAGE蛋囱电泳，与阴性 麓瓣照，在预期分子量范潮蠹毒蠛一弱鼓条蒂。秘嚣Ki．N狡摇爨缝往蛋骞+窭 现两个明显的峰。SDs．PAGE电泳分析表明，其中一个峰的蛋白条带符合预期蛋 露分子量。396nm激发鬣示绿色袋先，证实蛋的鏊因在宿主中褥弱表达。不过， 表达出的蛋白是瓣具有抗体活性还需要进～步的分析研究。 关键词：单穗抗体绿色荧光蛋白 势予标记 纂棱表达 却夕亨破学 却夕亨破学 ⑧ 硕士学位论文 Abstract Use of血e g佗en nuorescent protein(GFP)of Aequorea Victoria as a reporterhaS provided sensitive new印proaches for real time mo血toring in liViIlg ceIIs．More arld more reports have demonstrated that when GFP fused to target aIltibodyt量1e host cell can express bi胁ctio眦1如sion proteill，which has the nuorescem character of GFP and t}le antibody activi吼As a11 alteIna“ve to irnmllllofluorescence删croscopy’t}1e expression of GFP gene如sions has been used for tumor moIlitorin岛hi曲·血rou曲put screening drugs or researching me function ofthe acc印tor ofcenain cell f如toL In this p印era expression vector mat contai璐GFP gene a11d a11ti—Jung cancer scFv gene is conmuct．First，me v嘶able re百on of heavy chain and light chain is cloned丘om cDNAs虹Irougll PCR．Then，VL gene is amplified and modified谢也 linker p“mer，Equai m01e of VH and modi士ied VL are then subjected t0 sOE Iigadon a11d ScFv gene is amplified witll Vhbak and Vlf0 r．Sequcncing results indicate that no point mutation and fhme-slli茄ng mu伽on are brou曲t about d11ring PcR 啪plification．’11le GFP gene is cloned into pPROEX HTb plasmid betweenⅡ1e Nco I／)(ba I sites．ARer modified by PCR using s～1 and vlfor primers so that也e amplmed曲舯ent contains Bgl lI胁o I sites，the PCR product and t11e recombinant vector are digested wim B百II十xho I，廿1e Inodified sc知gene is i11Serted into the C-tenn血al o