抗软海绵酸单抗克隆抗体的制备及初步应用-水产养殖专业毕业论文.docxVIP

摘要腹泻性贝毒在我国沿海最为常见，是危害最大的有毒藻类毒素之～。软海绵 摘要 腹泻性贝毒在我国沿海最为常见，是危害最大的有毒藻类毒素之～。软海绵 酸(0A)是腹泻性贝毒晟主要成份。利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗软海绵 酸(OA)的单克隆抗体(McAb)，通过竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA) 初步建立了快速检测海产品和海水中软海绵酸免疫学分析技术。 用碳化二亚胺法将半抗原OA分别和牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA) 偶联制备成完全抗原0A—BSA和0A—OVA。0A—BSA为免疫抗原，偶联比是27：1； 0A-0VA为检测抗原，其偶联比为12：l。 六次免疫后，小鼠产生抗OA的特异性抗体，血清效价均大于1：100000。加 强免疫后，挑选效价最高的小鼠进行细胞融合，通过间接ELISA方法进行筛选。 间接ELISA的包被抗原稀释度为l：1000，酶标汜羊抗鼠IgG浓度为I：i000。利 用B淋巴细胞杂交瘤技术．培养出4株抗软海绵酸的单克隆抗体杂交瘤细胞，细 胞株均能稳定分泌抗体。 采用BALB／c小鼠体内诱生的方法大量制备单克隆抗体。腹水抗体效价大于 l：30000，最高可达l：50000。用饱和硫酸铵沉淀法粗提腹水中单克隆抗体．经G 蛋白亲和柱层柝得到高纯度、高活性的抗软海绵酸的IgG类革克隆抗体。 利用方阵滴定法确定竞争性ELISA包被抗原最适工作稀释度为l：800，单克 隆抗体最佳稀释度为l：50000，辣根过氧化酶标电羊抗鼠196稀释倍数为i000。 建立的竞争性ELISA检测软海绵酸的检出范围在31．2～150ng／mL之间。经贝类 样品添加测试，软海绵酸的回收率在87．2％～i12．3％之间，变异系数在5．4％～ 12％范围之内。 本项成果为建立快速、灵敏、经济的软海绵酸ELISA检测技术奠定了坚实 的基础，同时为其它海洋生物毒素检测，提供了可借鉴的经验。 关键词 软海绵酸 单克隆抗体 ELISA AbstractMy Abstract My research aimed to prepare monoclonal antibody(McAb)against okadaic acid (OA)，which WaS an important component of diarrhetic shellfish poison(DSP)，and develop an immunoassay of OA for the acute diagnosis in the aquatic product and sea water．An indirect competitive ELISA was founded on the base of monoclonal antibody． The hapten of OA Was conjugated to bovine serum albumin(BSA)and ovalbumin (OVA)according to EDC method．OA·OVA WaS the detectionagen and OA-BSA WaS the immunogen to inject BALB／C mice．The coupling ratio of OA tO BSA was 27：1 and to OVA WaS 12：1，BALB／c mice were injected by the immunogen and the titcr of anti-serum waS exceeded 1：100000 by the test oftwo—dimensional titration method，Spl enie cells of mice immunized bv 0A．BSA produce antibodies against OA．The eell fusion was carried out by mixing splenic cells witll the myeloma cells using polyethylene glycol(PEG)．After the cell fusion，hybridoma ceils were screened in a HAT medium．Hybridoma cells strains secreting monoclonal antibodies angaist OA were selected out by using indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)， the best dilution of coating antigen and the optional