血清白蛋白测定实验报告.docx

血清白蛋白测定实验报告 　　血清中总蛋白和白蛋白测定的实验方案　　血清总蛋白的测定：　　实验原理　　血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和2个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。实验器材分光光度计　　实验试剂　　/LNaOH溶液称取NaOH240g，溶于新鲜制备的蒸馏水约800ml中，定容至1L，贮于有盖塑料瓶中。　　2.双缩脲试剂称取硫酸铜结晶(CuSO4·5H2O)3g溶于新鲜制备的蒸馏水500ml中，加入酒石酸钾钠(NaKC4H406·4H2O），用以结合Cu2+，防止CuO在碱性条件下沉淀)9g和KI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析)5g。待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/LNaOH溶液100ml，并用蒸馏水定容至1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。　　～70g/L蛋白质标准液可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。实验操作　　取试管3支，混匀，置25℃30min或37℃10min，在波长540mm处比色，用空白管调零，测各管吸光度。　　参考范围　　60～80g/L。　　注意事项　　1.黄疸血清，严重溶血，葡萄糖，酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度。　　2.高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离心管，各加待测血清，再加蒸馏水和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。方法评价　　1.双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同。　　2.本法重复性好，RCV为4%，CCV为%；线性范围为0～140g/L；本法干扰少，并且大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手工操作，也便于自动化分析，已被推荐为　　测定血清总蛋白的参考方法。　　3.唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为～　　/L，这相当于70g/L的血清3～24μl，已能满足临床生化检验的需要。　　4.本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。　　5.临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合法、BCA法和免疫比浊法。　　临床意义　　血清总蛋白浓度受到血容量变化的影响，脱水时蛋白浓度相对增加，水潴留时则降低。在生理情况下，体位、运动等也可使血蛋白浓度发生轻微变化。　　1.血清总蛋白浓度升高　　各种原因失水所致的血液浓缩：如呕吐、腹泻、烧伤、糖尿病酮症酸中毒、急性传染病、急腹症等。　　网状内皮系统疾病：如多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、单核细胞性白血病等；　　风湿性疾病：如系统性红斑狼疮、多发性硬化。　　慢性传染病：如结核、梅毒等　　2.血清总蛋白浓度降低　　各种原因引起的血清蛋白丢失或摄入不足：如肾病综合征、营养不良、消耗增加；　　蛋白质合成障碍，如肝脏疾病。　　血清白蛋白测定　　血清白蛋白溴甲酚绿法测定实验：　　实验原理：在pH4．2的缓冲液中，白蛋白作为一种阳离子，结合阴离子染料溴甲酚绿形成蓝绿色化合物，在波长630nm处有吸收峰，其吸光度与白蛋白浓度成正比例，与同样处理的白蛋白标准液比较可求得血清中白蛋白含量。　　实验试剂　　1、0．5mol／L琥珀酸缓冲贮存液溶解Na0H10g琥珀酸56g于800m1蒸馏水中，用1mol／L氢氧化钠调至＋加水稀释至1000ml此液置4℃冰箱保存．　　2、BCG已存液：溶解于5m1Na0H中用蒸馏水稀释至250ml．　　3、叠氮钠贮存液：溶解叠氮钠40g于1000ml蒸馏水中。　　4、聚氧化乙烯月桂醚贮存液溶解聚氧化乙烯月桂醚于80ml蒸馏水中，加热助溶然后加蒸馏水至10ml．　　5、BCG试剂：与1L容量瓶中盛蒸馏水约400m1，加琥珀酸缓冲贮存100ml，用吸管准确加入BCG贮存液8．0m1，并用蒸馏水将吸管壁上残留的少量染料冲洗到液体中加叠氮钠25ml，聚氧化乙烯月桂醚25ml最后用蒸馏水稀释到刻度，配好BCG试剂应为土。　　6、40g／L白蛋白标准应用液　　实验步骤　　波长630nm。用空白管调零，用定量加液器加