曼氏迭宫绦虫半胱氨酸蛋白酶的表达与鉴定及其用于裂头蚴病血清学诊断的研究-病原生物学(人体寄生虫学)专业毕业论文.docx

摘 摘 要 万方数据 万方数据 曼氏迭宫绦虫半胱氨酸蛋白酶的表达与鉴定及其用于裂 头蚴病血清学诊断的研究 博士研究生 刘莉娜 导 师 王中全 教授 郑州大学基础医学院人体寄生虫学教研室（450052） 河南省分子医学重点学科开放实验室 （450052） 摘 要 裂头蚴病 (sparganosis) 是由迭宫属绦虫的幼虫-裂头蚴 (plerocercoid) 侵 入人体引起的一种严重的自然疫源性疾病，在我国及东南亚国家该病主要是由 曼氏迭宫绦虫 (Spirometra mansoni) 裂头蚴引起的。裂头蚴病的临床表现因寄生 部位而异，复杂多样且缺乏特异性。目前裂头蚴病的诊断主要是病原学检查、 影像学检查和血清学检查，但病原学诊断非常困难，活检时很难发现虫体，尤 其是当裂头蚴在中枢神经系统寄生时，手术探查的风险较大；影像学检查只能 定位 ， 不能定性。 应用 裂头蚴 虫体 可溶 性抗原 ( 粗抗原 ) 及排泄分泌 (excretory-secretory，ES) 抗原进行血清学诊断时易与其他蠕虫病发生交叉反应。 为了寻找敏感和特异的早期诊断抗原，我们前期将裂头蚴可溶性抗原与ES抗原 分别进行了双向电泳，应用裂头蚴早期感染血清进行Western blotting 鉴定，将 早 期 感 染 血 清 识 别 的 蛋 白 点 进 行 质 谱 分 析 后 鉴 定 出 一 种 半 胱 氨 酸 蛋 白 酶 (cysteine protease，CP)。CP是在其活性中心具有半胱氨酸残基的一种蛋白水解酶， 具有良好的抗原性，在寄生虫生长与发育中具有重要的生物学功能。本研究对 裂头蚴半胱氨酸蛋白酶 (SeCP，ID：D63670；蛋白ID：BAA09820，GI:1834307) 全长基因进行了生物信息学分析、克隆、原核表达，并对重组SeCP (rSeCP) 进 行了免疫学鉴定、酶活性及功能特性分析，将其用于不同剂量裂头蚴实验感染 小鼠后不同时间血清特异性抗体的检测，通过ELISA观察了rSeCP诊断裂头蚴病 人的敏感性与特异性。 I 材料与方法 1. 裂头蚴、血清、质粒和菌株 从河南省开封地区感染裂头蚴的野生青蛙肌肉中分离裂头蚴，按重度 (5 条/只)、中度 (3 条/只)、轻度 (1 条/只)分别感染小鼠，感染后 2~28d 隔天采集 血清备用。裂头蚴感染家猫后收集成虫经形态学与分子生物学鉴定为曼氏迭宫 绦虫(Spirometra mansoni)。试验血清包括裂头蚴、旋毛虫、弓形虫与日本血吸 虫感染小鼠血清，以及裂头蚴病、棘球蚴病、旋毛虫病、日本血吸虫病、并殖 吸虫病、华支睾吸虫病、猪囊尾蚴病等寄生虫病患者血清。克隆载体 pGEM-T (Promega)、大肠杆菌 DH5α，原核表达载体 pMAL-c2X 和 TB1 均购自 New England Biolabs。 1. SeCP 的生物信息分析及克隆、表达及鉴定 利用 NCBI、EMBI、ExPasy 等在线网站对 SeCP 进行生物信息学分析，然 后对 SeCP 基因进行分子克隆、表达和纯化，将纯化后的 rSeCP 免疫 BALB/c 小鼠获得免疫血清并对其引起的免疫应答类型进行了观察，通过 Western blotting 分析其抗原性和免疫原性，应用 RT-PCR 观察 SeCP 基因在曼氏迭宫绦 虫不同发育期的转录情况；应用间接免疫荧光试验 (IFT) 对 SeCP 蛋白在曼氏 迭宫绦虫不同发育期的表达及其在虫体组织的定位进行了分析。 2. rSeCP 酶活性鉴定及功能分析 将纯化的 rSeCP 进行明胶酶谱分析 (含有 0.1% 明胶的 12% SDS) 检测其活性。采用 Z-Phe-Arg-AMC 测定蛋白酶的活性以及酶动力学分析，在 激发波长为 355 nm 和发射波长为 460 nm 时检测 rSeCP 催化生成的产物 AMC 的生成速率，进而得到 rSeCP 的催化效率，并测定了温度、pH、金属离子(Cu、 Mn、Zn)和特异性抑制剂 (E-64 等) 对 rSeCP 活性的影响。分别应用兔与人的 免疫球蛋白、牛血红蛋白(Hb)、纤连蛋白、胶原蛋白 I 与 IV 及牛血清白蛋白观 察 rSeCP 的水解功能。将 rSeCP 与 rSeCP 免疫血清孵育后，观察 rSeCP 免疫血 清对 rSeCP 酶活性及水解功能的抑制作用，以及抗 rSeCP 抗体依赖细胞介导的 细胞毒作用( ADCC) 实验。 II 3. rSeCP 用于裂头蚴感染小鼠与裂头蚴病人血清抗体的检测 应用 rSeCP 与裂头蚴 ES 抗原分别建立检测裂头蚴抗体 IgG 的 rSeCP-ELISA 与 ES-ELISA 方法，检测不同剂量裂头蚴感染小鼠后不同时间血清抗体水平， 观察 rS