弥漫性脑损伤时间推断的实验研究-法医病理学专业毕业论文.docxVIP

中山人学硕L学位论文 中山人学硕L学位论文 弥漫性脑损伤时间推断的实验研究 弥漫性脑损伤时间推断的实验研究 硕士研究生：陈梅花 导 师：胡丙杰副教授 中山大学基础医学院法医病理教研室 摘要 颅脑损伤是法医病理工作中常见机械性损伤之一，脑损伤时间的推断尤其受 到重视，寻找推断脑损伤时间的实用性生物学指标是法医病理工作者一直致力解 决的问题。已有专家利用免疫组化、原位杂交、图像分析等技术作了大量的动物 实验研究；亦有学者利用这些实验方法做脑损伤时间推断的应用研究，但目酊尚 未找到可应用于法医检案的切实可行的生物学指标。 本研究建立改良的marmarou大鼠弥漫性脑损伤模型，应用常规HE染色和镀 银染色法进行模型的形态学研究。在此基础上，应用免疫组织化学方法和图像分 析方法，探讨胶质细胞源性神经营养因子(G1ial cell Line—derived Neuro— Trophic Factor， GDNF)和脑源性神经营养因子(Brain—derived Neurotrophlc Factors，BDNF)在脑组织不同部位的表达水平随损伤时间的变化规律，以期为 脑损伤时间推断寻找客观指标提供新的实验依据。 1材料与方法 l_1大鼠闭合·性弥漫·I生脑损伤模型的建立 (1)打击装置(改良marmrou自由落体打击装置)1．金属管：长1m，直径 1．5cm；2．金属棒：直径1．2cm，长45cm，重量4509；3．海绵挚：4．大鼠铁头盔； i．铁支架；6：细线。 中山犬学硕，L学位论文 中山犬学硕，L学位论文 弥漫性脑损伤时间推断的实验研究 (2)SD大鼠(中山大学北校区实验动物中心提供)45只，雄雌不限，体重： 250±L09；随机分9组，每组5只，分组：正常对照组；伤后 lh，3h，6h，12h，24h，48h，72h，120h组。 (3)正常对照组腹腔麻醉后断颈处死；打击装置分别打击40只大鼠，按时间 段随机分组，腹腔麻酵后断颈处死，完整取出脑组织，所有取材均用lO％福尔马 林液固定72h，在大脑正中外则l一2m处作矢状切面，取材厚度约5m，石蜡包埋， 切片厚度2um，分别进行HE染色和镀银染色。 1．2 GDNF．BDNF在大鼠弥漫·陛脑损伤后表达变化的实验研究 1．2．1 sP法免疫组化染色 石蜡切片来自动物模型的蜡块，切片厚度为2um：免疫组织化学试剂：兔抗鼠 GDNF(Santa Cruz Biotechn0109y Inc，cat4SC一328)抗体，兔抗鼠BDNF(武汉 博士德生物制剂公司)抗体，sP试剂盒(福建迈新公司)，DAB显色剂(福建迈新 公司)。 1．2．2免疫组化结果图像分析 免疫组化结果应用Yc．TY～2050型法医病理图像分析系统作定量测量(灰度域 O一256，O为白，放大倍数10×20)，每张切片随机取5个视野，分别测量GDNF．BDNF 阳性反应物面积密度，灰度值。 1．2．3统计学处理 应用SPSS统计软件对图像分析数据作统计学处理，统计学处理采用单因素方 差分析，多组内两两比较。采用LsD法，如方差不齐的数据采用KRusKAL—wALLIs 秩和检验。 II 中山大学硕上学位论文 中山大学硕上学位论文 弥漫性脑损伤时间推断的实验研究 2结果 2．1弥漫性脑损伤模型的建立 肉眼观察：大脑表面无明显的改变。镜下HE染色：损伤出血呈局部弥漫性分 布，大脑、小脑和脑干均可见点状、片状出血灶，微血管出血；脑组织疏松，呈 海绵状；神经细胞胞体肿胀、核偏位、核周间隙增大：部分星型胶质细胞胞质嗜 酸性变，小胶质细胞增生。镀银染色：轴索不规则增粗、卷曲、断裂。同一轴索出 现粗细不均，弯曲走行成波浪状；同一条轴索的不同部位以及不同轴索粗细差异 大：断裂轴索断端膨大。 2．2免疫组化染色结果 2，2．1 GDNF免疫组化表达分布及其随时间的变化 GDNF阳性结果为棕褐色，正常对照组可见大脑、脑于、小脑分子层细胞胞质 有散在GDNF浅棕色阳性反应，小脑浦肯野细胞胞体有深棕色强阳性反应，阳性信 号主要位于神经胶质细胞和神经元胞质内。实验各组阳性信号表达部位与正常对 照组相同，表达强度经图像分析，测量阳性反应物平均灰度值及面积密度值，作 统计学分析结果示：染色强度在脑损伤后lh表达开始增高，3h表达达最高峰，6h 回落不明显，12h有明显回落，但高于正常水平，此后继续回落但高于正常对照水 平到120h。阳性物面积密度变化趋势无统计学意义(PO．05)。 2．2．2 BDNF免疫组化表达分布及其随时间的变化 BDNF阳性结果为棕黄色，正常对照组可见大脑、脑干、小脑分子层细胞有散 在BDNF弱阳性反应，小脑浦肯野细胞胞体有强阳性反应，阳性反应物主要位于神 经元胞质内。实验各组阳性信号表达部位与正常对照组相同；表达强