猕猴桃溃疡病相关细菌的鉴定及致病性研究-植物病理学专业毕业论文.docxVIP

Dissertation for Master’s Degree Identification and pathogenicity of bacteria associated with kiwifruit canker Supervisor: Prof. Genjia Tan Associate Prof. Lixin Zhang Master Candidate: Shasha Li Major: Plant Pathology Anhui Agricultural University Hefei, Anhui, China June 2013 独创性声明 本人声明所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为 获得安徽农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名:在荡荡 签字日期: }17 )3 年 d月 3 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 文件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将 学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论 文全文数据库))，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文，向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适 用本授权书)。 学位论文作者签名 v在荡荡 签字日期 :tol 年4 月乡面  指导教师签名:业扫一 签字日期:炉3年 j月3 日 I I 摘 要 猕猴桃溃疡病是一种世界性的侵染猕猴桃的细菌性病害，该病害危害极大，严 重时可致使全园毁灭，造成严重的经济损失。该病害在中国、日本、韩国、意大利、 新西兰等主要猕猴桃种植国家均有发生。目前猕猴桃溃疡病在我国猕猴桃产区的发 生呈上升趋势，个别年份甚至大流行。由于我国对猕猴桃溃疡病的病原缺乏系统的 研究，因此，本研究分别在安徽、陕西、重庆等地猕猴桃果园重病区采集病样，对 该病害的相关细菌进行了分离，并对其做了表型鉴定、分子特征分析以及致病性测 定等研究。主要研究结果如下： 1．猕猴桃溃疡病相关细菌的分离及表型鉴定 本研究采用研磨稀释分离法分 别用三种培养基对采集的病样进行分离，共得到 328 株出现频率高并具有代表性的 菌株，这些菌落在 BPA 培养基上培养的形态有三类：一类是菌落呈白色，圆形隆起， 边缘呈光滑的波浪状，共 311 株。其中有 282 株革兰氏染色为阴性，能动，好氧， LOPAT 试验为（+ + – + +），七叶苷水解和明胶液化试验为阳性，能利用葡萄糖产 酸，能利用葡萄糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖，乳糖，麦芽糖，并且能在 KB 培养 基上产荧光色素，初步鉴定为荧光假单胞菌 Pseudomonas fluorescens。另 29 株革兰 氏染色为阴性，兼性厌氧，能动，LOPAT 试验为（+– – –+），产荧光色素试验、明 胶液化试验均为阴性，过氧化氢酶反应和七叶苷水解试验为阳性。第二类是菌落黄 色，圆形光滑，全缘。第三类是菌落初呈乳白色，后产生黄色素，菌落生长快。 2．猕猴桃溃疡病相关细菌的分子特征分析 利用丁香假单胞猕猴桃致病变种的特异性引物 PsaF1/R2、PsaF3/R4，对 125 株 细菌的全基因组 DNA ITS 区域进行双重 PCR 扩增，凝胶电泳检测结果表明仅意大 利提供的 P. syringae pv. actinidiae 菌株 F285、Fc84、F28c 在 175 bp 和 280 bp 左右 的位置检测到两条扩增片段，分离所得细菌均未检测到目的片段。 利用细菌 16S rRNA 片段通用引物 P1 F/P2 R，对 125 株细菌全基因组 DNA 做 PCR 扩增，均得到一条大小约为 1500 bp 目的片段，分别用限制性内切酶 HaeIII 和 MSPI 对 16S rRNA-PCR 扩增片段酶切，酶切图谱显示，内切酶 HaeIII 将菌株分为 四类，MSPI 将菌株分为五类，酶切结果与菌株的表型鉴定结果大体一致。选取 14 株代表性细菌，将其 16S rRNA-PCR 扩增片段进行 T/A 克隆、序列测定，对获得序 列在 NCBI 数据库中进行 Blast 搜索，结果显示意大利提供的 P. syringae pv. actinidiae 菌株 F285、Fc84、F28c 的 16S rRNA 片段与 P. s. pv. actinidiae 同源性达 99%，菌 株 AHK-1、AHK-2、A1-