米诺环素对大鼠原代神经元和海马脑片缺氧缺糖及NMDA损伤的保护作用-药理学专业毕业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文米诺环素对大鼠原代神经元和海马脑片缺氧缺糖及 浙江大学硕士学位论文 米诺环素对大鼠原代神经元和海马脑片缺氧缺糖及 NMDA损伤的保护作用 浙江大学医学院药理学 2001硕士研究生：何巍 导 师：魏尔清教授 摘 要 前言： 米诺环素(盐酸二甲胺四环素，minocyeline hydrochloride)为第二代人工半合成四环素 类抗生素，其抗菌谱与四环素相似。米诺环素口服后迅速被吸收，脂溶性较高，组织穿透性 好，可以通过血脑屏障作用于中枢神经系统。近年表明，在脑缺血、脑外伤、阿尔茨海默氏 病和帕金森病模型上，米诺环素均有显著的神经保护作用。其中，在全脑和局灶性脑缺血模 型上，发现四环素类抗生素具有减少梗死面积等脑保护作用．治疗时间窗较传统的抗脑缺血 药物更妖，其中米诺环素的作用最强：米诺环素的神经保护作用与其抗值作用无芰。目前， 已报道该类药物神经保护作用的一些机制，但脑缺血损伤发生时．多条通路都被激活，而米 诺环素在备种模型上均表现出了神经保护作用，因此其抗脑缺血的作用环节尚待阐明。谷氨 酸是脑内最主要的内源性兴奋性氨基酸。其受体主要包括N一甲基-D．天冬氨酸(NMDA)受体 和a·氨基·3一羟基-5-甲基．4一异嚼唑丙酸(AMPA)受体等几种亚型。脑缺血、脑外伤与慢性退行 性神经疾病等病理过程中．谷氨酸通过激动其突触后膜谷氨酸受体产生*奋性毒性，参与神 经元损害，尤其NMDA受体介导的兴奋性毒性是神经元早期缺血性损伤的重要机制。NMDA 受体亦可介导缺血性脑损伤病理中神经胶质细胞活化及产生损伤性物质(如iNOS。ICE等) 释放。米诺环素的神经元保护作用可能与其抑制神经胶质细胞活化及损伤性物质释放有关， 但米诺环素抑制NMDA受体介导直接效应还是中间环节介导同接效应，未见报道。 l 浙江大学硕士学位论文目的 浙江大学硕士学位论文 目的 (1)建立神经元缺氧缺糖(OGD)模型。 (2)在火鼠大脑皮层神经元和海马脑片OGD和NMDA损伤模型上，观察米诺环素的 保护作_【：}j，井分析其作用环节(着重探讨与NMDA受体的关系)。 (3)探讨米诺环素的保护作用时间依赖特点。 方法： (】)建立神经元OGD模型：以常规方法原代培养新生大鼠皮层神经元，神经元培养 至10～12 d用于-实验。以平衡盐缓冲液替换细胞培养液放入气密罐，罐中充以95％N2和 5％C02的混合气体，体外模拟缺血过程。测定OGD不同时间对细胞造成的损伤，观察形态 学变化，井检测MTl、还原产物评价神经元活性：用阳性药物依达拉奉和神经生长因子评价 此模型有效性。 (2)在神经元OGD模型和NMDA损伤模型观察米诺环素的作用：观察米诺环素对损 伤后神经元形态变化及神经元活性(MTT法)的影响：NMDA受体拮抗剂MK-801作为对 照药。在神经元OGD处理前后不同时间点加入米诺环素，考察米诺环素的治疗时间窗。 (3)在大鼠海马脑片OGD和NMDA损伤模型观察米诺环素的作用：以透光性改变评 价大鼠海马脑片活性变化，在OGD或NMDA处理】0 rain及复灌期间，观察米诺环素或 MK-801对脑片透光性变化的作用。数据以}±j表示，用方差分析检验差异的显著性，以 SPSS for Window 10．0进行统计学处理。 结果： (”神经元OGD过程中氧分压及葡萄糖浓度变化：OGD 45 rain后，缺氧盒中平衡盐 缓冲液的p02从(152 4-5)mmHg(对照)降至(29士I)mmHg∞=5，PO．01)：密闭5 h 后重复测定，对照为(161士4)mmHg。OGD组为(28±2)mmHgm=5，P(o．oD。OGD 组葡萄糖含量无法测到，对照组为(1．63士0,27)g／L(n；5)。证明实验条件符合缺氧缺糖。 随OGD处理时间增加。MTT试验的光密度(ODm)逐步降低。3 h开始出现显著的损伤(P (0．001)：OGD 5 h处理后．损伤作用更明显。阳性对照药神经生长因子和依达拉奉浓度依 赖性提高OD4∞，其中0．01、O．1、1、10pmol／1．,作用显著(P0．01)。 2 浙江大学硕士学位论文(2)米诺环素对神经元OGD及NMDA损伤的作用：米诺环素1、10 浙江大学硕士学位论文 (2)米诺环素对神经元OGD及NMDA损伤的作用：米诺环素1、10 gmol／L对皮层神 经元OGD 3 h后再灌24 h损伤有保护作用；10、100 gmoFL对NMDA(509molFL，3 h) 诱导的皮层神经元损伤有保护作用；NMDA受体拮抗剂MK-801(1．umol／L)对两种损伤都 有保护作用。进一步考察米诺环素的治疗窗，结果显示OGD 3 h后再灌2 h加入米诺环素 1 0 Iamol／L依然具有神经元保护作用。 (3)米诺环素对海马脑片O