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霍乱弧菌化验检测报告 　　霍乱弧菌检验操作规程　　1范围　　本操作规程规定了带菌者粪便，患者粪便、呕吐物、肛拭子，外环境水样，水生动物、食品等标本中的霍乱弧菌的检验方法。　　2检验依据　　国家传染病诊断标准：WS289—XX　　卫生部疾病控制司《霍乱防治手册》第五版　　北京市卫生防疫站《卫生防疫微生物检验操作规程》《北京市常见传染病防制工作手册》　　3设备和材料　　冰箱：-20℃～4℃。恒温培养箱：36±1℃。　　暗视野显微镜：10×～100×。　　架盘药物天平：0g～500g,精确至。锥形瓶：100mL、500mL。　　灭菌吸管：1mL(具刻度)、10mL(具刻度)。灭菌平皿：直径90mm。　　灭菌试管：10mm×75mm、16mm×160mm.。灭菌注射器：1mL。载玻片。盖玻片。　　无菌棉签。　　500mL灭菌采样瓶。生物安全柜：Ⅱ级。　　4培养基和试剂　　碱性蛋白胨水。庆大霉素琼脂。普通营养琼脂。　　半固体培养基。　　霍乱弧菌单克隆抗体(国家CDC流研所提供，5—10μL/菌落)。泰国S＆A诊断血清—　　7操作步骤　　快速辅助诊断：其结果只是初步报告，不是确诊报告。动力及动力抑制试验：　　如是急性期病人的水样便，则用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力；或加生理盐水1滴在玻片上，用接种环取较干的便1环放置生理盐水中研匀，盖上盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力；高度可疑的标本可取已增菌的碱性蛋白胨水1滴在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动即动力试验阳性，否则阴性。　　动力试验阳性的标本，则取O1和O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各2滴放置玻片上，取标本1滴或1环放在其中研匀，盖上盖玻片，用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动，如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性，否则阴性。动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告，但不是确诊报告。双阳时口头报告高度可疑。分离培养　　粪便、呕吐物和肛拭子：对急性期病人水样便标本在碱性蛋白胨水增菌培养的同时可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上；所有病人标本都应接种碱性蛋白胨水增菌培养。37℃增菌6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，把接种环在试管壁上轻轻碰一下，待接种环上留有残液后划线接种庆大霉素琼脂培养基，划线时接种环在基线处反复多次划线以接种的菌液干了为准，最后用接种环从基线处开始不间断划线到完成或四区划线。37℃培养，18h-24h。必要时可取第一次增菌液1mL转种于8-10mL碱性胨水管中37℃二次增菌培养6～8h后做分离。　　水样：十倍浓缩碱胨水增菌培养法　　水体的采集一般用无菌的500mL水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内)500mL，2～3小时内送检。取450mL水样，用1mol/L氢氧化钠调整至。然后加10倍浓缩碱性胨水50mL。为抑制杂菌可再加入1%亚碲酸钾mL和1000单位/mL青霉素1mL。37℃培养过夜划线接种庆大霉素琼脂培养基，接种划线方法同。培养时把瓶盖打开三分之一。培养后取菌膜下表层培养物mL接转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h，再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方法同。　　食品及水产品样本：液体食品：同　　涂抹标本：使用无菌棉签涂抹3～5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔或食品等表面，直接接种到10mL碱性蛋白胨水，37℃增菌培养8～12h划线培养。同时取菌膜下表层培养物接种庆大培养基分离培养同时吸～mL转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养8～12h再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方　　2　　图1　　3　　法同。　　固体食品：25-50克标本放入碱性胨水中增菌培养同。标本与碱性胨水的比例为1：5。　　可疑菌落：每一庆大霉素琼脂平板上各挑取9-10个少于9个的全部挑取)可疑菌落做玻片凝集试验进行鉴定。可疑菌落的形态：略带青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑湿润。如延长培养时间或室温放置到48h，菌落略带黄色，中心形成黑色金属碲沉淀。鉴定分型　　玻片凝集试验　　01、0139群霍乱弧菌初步鉴定：挑取可疑菌落与01群、0139霍乱弧菌单克隆抗体做玻片凝集试验。如可疑菌落很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集颗粒，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均为阴性时方可报告：未检出01、0139群霍乱弧菌。　　分纯：用接种环取抗原抗体复合物接种于普通营养琼脂板上分纯，37℃过夜培养。复核及分型：挑取可疑菌落和纯培养物进行复核及分型。01、0139群霍乱弧菌用诊断血清和单克隆抗体复核