马铃薯原生质体遗传转化体系的构建-蔬菜学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 否 如需保密，解密时间 年 月 日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果．尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意． 研究生签名：专趸诲 时间： D 6年 ‘月zL日 学位论文作者签名：靠趸玲 导师签名：砌v，I 签名日期： 。‘年6月n日 签名日期：≯秽砭军∥月2。日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 摘 摘 要 马铃薯(Solanum tuberosum L．)是世界第四大粮食作物且用途广泛，发展其生 产具有重要的意义。近年来，马铃薯常规育种工作遇到了难以跨越的“生物学路障”， 而基因工程技术对于转移目标性状具有很大的目的性，已经成为目前改良作物品性 的重要手段。原生质体作转化受体较传统外植体更能整合大片段DNA，但目前马铃 薯这方面的研究还不够充分。 本研究以马铃薯无性系84(2n=4x=48)为材料，分离其叶肉原生质体作转化 受体，选用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因，采用共孵育(原生质体与质 粒DNA直接融合)法，PEG介导转化法和电击穿孔转化法，将外源质粒(pBIN m-gfp5-ER和SK-gt2,)DNA转化到马铃薯原生质体中。通过转化子中绿色荧光蛋白 。的表达，研究马铃薯原生质体遗传转化技术体系。主要结果如下： 1．SK-gfp转化载体的构建从pBlN m-gtp5一ER(14．7 kb)上酶切出gp基因， 装入SK载体，构建SK-gfp质粒，长度约4．8 kb，g和基因经序列测定，与pBIN m-gfp5．ER上gfP序列比对，相似性为100％。 2．共孵育即将一定浓度的外源DNA(60、80、100 I_tg／mL)和纯化后的原生 质体直接共培养，共得到163个愈伤组织，其中转化子30个，转化效率18．4％。 3．PEG介导转化纯化后的原生质体用PSL(甘露醇O．3 moFL，M【gCk 15 mmol／L，MES 0．1％，pH 5．8，高温灭菌)悬浮，加入一定浓度的质粒DNA(75、 100 Ixg／mL)，充分混匀后静置片刻，然后均匀地滴于无菌培养皿的底部，静置3min， 待大多数细胞沉降后，在每滴正上方加等量的12．5％或25％的PEG溶液，分别静置 10 min或5 min，诱导外源DNA进入原生质体。共得到愈伤组织149个，有70个 是转化子，转化效率为47．O％，其中PEG(12．5％，10 min)的转化效率为51．9％， 高于PEG(25％，5 min)的44．2％，且二者之间在P=0．05水平上存在显著性差异。 4．电击穿孔转化电转化仪：EppendorfMultipomtor 4308型，转化室为250止 螺旋型铂金电极，间距0．02 cm；电转化液的组成：O．35 mol／L甘露醇+O．1 mMCaCh， pH 5．8，高温灭菌；脉冲电压为20v，脉冲次数n=l。得到愈伤组织312个，其中 转化子183个，转化效率最高，达到58．7％。 5．比较外源DNA长度对转化效率的影响时发现，共培养转化和电击穿孔转化 时，SK-g宙的转化效率比pBIN m-gCk5-ER的高；而在PEG介导转化中出现了相反 的情况。 6．通过研究DNA浓度与转化效率的关系发现：只有在共培养转化时，。DNA浓 度为80}Ig／mL的转化效率与60、100 Ixg／mL的效率在P=0．05水平上存在显著性差 异，PEG介导转化和电击穿孔转化时设立的两浓度(75、100 lag／mL)所对应的转化 效率不存在显著性差异。 7．三种转化方法共得到愈伤组织624个，其中转化子283个。对三种转化方法 4 得到的转化子效率比较得出，比较适宜的马铃薯原生质体转化方法是电击穿孔转化 得到的转化子效率比较得出，比较适宜的马铃薯原生质体转化方法是电击穿孔转化 法，基本确立马铃薯原生质体遗传转化技术体系。 关键词：马铃薯；原生质体；遗传转化；绿色荧光蛋白(GFP) ABSTRACTThe ABSTRACT The potato(Solanum tuberosum L．)is the fourth food crop with multiple USeS in the world．In recent years，the traditional breeding has met insurmountable‘bi