慢性乙型肝炎患者血清对肾小管上皮细胞的作用及其机制研究-内科学专业毕业论文.docxVIP

慢性乙型肝炎患者血清对人肾小管上皮 慢性乙型肝炎患者血清对人肾小管上皮 细胞的作用及其机制研究 摘 要 目的：通过观察慢性乙型肝炎(CHB)患者血清HBV DNA和细胞因 子转化生长因子．13 1(TGF．B 1)水平的变化，以及慢性乙型肝炎患者血清 对体外培养的人近端肾小管上皮细胞(IlK一2)凋亡、Fas表达及表型转化 的影响，初步探讨乙型肝炎病毒(HBV)和转化生长因子一13．在人肾小管上 皮细胞损伤中的作用机制，为临床治疗和／或预防乙型肝炎病毒相关性’肾炎 (船VGN)提供理论依据。方法：44例慢性乙型肝炎轻度患者(均为泸 州医学院附属医院感染消化科住院患者)，采用荧光定量聚合酶链反应 (PCR)技术检测HBV DNA含量。根据HBV-DNA检测结果将患者分为HBV DNA阴性血清组(20例)和HBV DNA阳性血清组(24例)，并以20例 健康人血清作为对照。无菌采集清晨空腹血4ml，于无菌操作台内分离血 清，．70℃低温冰箱保存备用。①采用双抗体夹心酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测血清中细胞因子转化生长因子．D 1。检测不同浓度标准品 OD450值，以标准品浓度作横座标，OD值作纵座标，以平滑线连接各标准 品的座标点，手工绘制标准曲线。通过血清标本的OD值在标准曲线上查 出其浓度。②将HK．2细胞于培养瓶培养至85％融合后，以5×103传代于 24孔培养板，分别加健康人血清50I．tl、HBV DNA阴性血清509l、HBV DNA阳性血清509l。于37。C、95％空气和5％--氧化碳的条件下培养72 小时后，O．25％胰酶消化收集细胞。用PBS重悬细胞，调节细胞浓度约5 ×105／ml，取lml置于流式上机管中，1500 rpm离心5min，弃上清液。取 500pl 500pl Buffer液重悬细胞，加Annexin v及PI各5 u1，室温避光反应5 min， 以流式细胞仪(FCM)检测HK．2凋亡情况。③将HK一2细胞于培养瓶培 养至85％融合后，以5×103传代于24孔培养板，分别加健康人血清50乩 HBV DNA阴性血清50“l、HBV DNA阳性血清509l。于37。C、95％空气 和5％二氧化碳的条件下培养72小时后，0．25％胰酶消化收集细胞。用PBS 重悬细胞，调节细胞浓度约5×105／ml，取lml置于流式上机管中，1500 rpm 离心5min，弃上清液。取5009l Buffer液重悬细胞，加CD95一FITC鼠抗人 单克隆抗体209l，室温避光反应20min，以流式细胞仪检测HK．2Fas表达。 ④将HK．2细胞于培养瓶培养至85％融合后，以l×106传代于预置玻片的 6孔培养板中。分别加：健康人血清509l、HBV DNA阳性血清509l。于 37。C、95％空气和5％--氧化碳的条件下培养，72小时后取出玻片进行免 疫组化染色。用免疫组织化学技术检测HK．2角蛋白(cK)、o一平滑肌 肌动蛋白(a．SMA)的表达。分析①慢性乙型肝炎患者血清对HK．2凋亡 的影响。②慢性乙型肝炎患者血清对HK．2表面分子Fas表达的影响。③ HBV DNA定量与HK．2凋亡率之间的关系。④rmv DNA阳性血清对HK。2 转分化的作用。⑤慢性乙型肝炎患者血清转化生长因子B，水平的变化及与 HK．2凋亡的关系。结果：①对照组HK-2凋亡率为(4．25±0．65)％，HBV DNA阴性血清组HK一2凋亡率为(8．12±2．80)％，HBV DNA阳性缸清2且 HK一2凋亡率为(19．01±5．85)％。HBV DNA阴性血清组及HBV DNA阳 性血清组HK．2凋亡率均高于对照组(PO．001)，HBV DNA阳性血清组 HK一2凋亡率高于HBV DNA阴性血清组(PO．001)。②对照组HK一2Fas 表达率为(2．33±1．09)％，HBV DNA阴性血清组Ⅷ(．2Fas表达率为(6．96 ±2．76)％，HBVDNA阳性血清组HK一2Fas表达率为(17．58±8．35)％。 HBV HBV DNA阴性血清组及HBV DNA阳性血清组HK．2Fas表达率均高于对 照组(P0．001)，HBV DNA阳性血清组HK．2Fas表达率高于HBV DNA 阴性I血清组(Po．001)。③直线相关分析显示HBVDNA阳性血清组HK．2 凋亡率与慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA定量呈显著正相关(FO．657)。 ④对照组HK．2角蛋白表达强阳性，Q．平滑肌肌动蛋白表达阴性，HBV DNA阳性血清组HK一2角蛋白表达弱阳性，(11．平滑肌肌动蛋白表达强阳 性。⑤对照组血清TGF-0 l水平为(81．404-40．75)ng／ml，慢性乙型肝炎患者 组血清TGF-13 1水