免疫细胞检测技术.docVIP

《免疫学技术》综述 《免疫学技术》综述 2009．6 免疫细胞检测技术 作者： 学号：  免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其他抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有一定意义。本综述将就免疫细胞的分离、免疫细胞功能的检测和细胞凋亡的检测三个方面主要方法的基本原理作简要介绍。 一．免疫细胞的分离 免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是分离各种免疫细胞的基础。细胞的形态特征反映在其物理性质上，如各种细胞的大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异;而细胞的功能特征往往由该细胞膜表面的蛋白质(表面标记)来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的受体等。根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离出来。免疫细胞分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于细胞表面标记的分离方法。 基于细胞物理性状的分离方法 (一)根据各种细胞比重的差异 1.自然沉降法 2.密度梯度离心法 人外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.00左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为1.075左右。利用密度在l.077万±0.001之间近于等渗的Ficoll-Hypque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层被的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液，故位于分层被界面上，这样就可获得PBMC o（如图1-1所示） 图1-1 淋巴细胞分离示意图 3.改变细胞密度法 巨噬细胞能够吞噬铁粉，增加其比重，通过密度梯度离心或磁场将其分离;T细胞能够与绵羊红细胞形成花环，形成的花环复合物比重大，借助密度梯度离心将T细胞分离。 （二）根据细胞吸附特性 巨噬细胞能够非特异性粘附于玻璃或塑料表面，根据这种特性可以将巨噬细胞从混合细胞群体中分离;B细胞能够粘附于尼龙棉上.通过尼龙棉柱时被阻滞，从而将其与其他细胞分开。 (三}根据细胞对渗透压变化的敏感度 倒如红细胞对低渗敏感.通过低渗处理能够裂解红细胞。 基于细胞表面标记的分离方法 (一)补体细胞毒分离法 采用特异性抗细胞表面标记的抗体，结合具有该表面标记的细胞，在补体的作用下，使具有该表面标记的细胞发生溶解，将其从混合细胞群体中去除。 {二}免疫磁珠分离法 磁性微珠是上世纪80年代初以高分子材料和金属离于(如Fe3O4)为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁性微珠。在班液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 免疫磁性微珠主要用于细胞的分离和纯化，其基本原理及步骤是:首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，便与致敏磁珠结合的细胞与其他物质分离，达到纯化、分离的目的。通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。 免疫磁珠分离细胞方法简便，快速，无需特殊的设备，且分离纯度高，产率大，近年来已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T、B淋巴细胞、内皮细胞、造血祖细胞、单核/巨噬细胞及胰岛细胞、多种肿瘤细胞等。 近年来，人们又开发出与生物素结合的单抗—亲和素/链霉亲和素-生物素结合的磁性微珠的实验方法，这种方法旨在利用生物素-亲和素间的高亲和力和生物放大作用来增强磁性微珠与细胞的结合力，从而提高细胞的分离效率。为了对细胞分离效果迅速进行分析，可将荧光素(如FITC)标记在亲和素/链毒亲合素表面，使所分离的细胞在流式细胞仪(FCM)上立即得到测定分析，从而省去了免疫荧光染色的时间。 {三}流式细胞术 流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系统和细胞分离纯化系统组成。（其基本构成框架见下页图1-2） 其工作原理及特点为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液