实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌.pptxVIP

实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌;实 验 目 的;实 验 原 理; 转化(Transformation) 是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液，在0℃低温处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击（如42 ℃ ）下，细胞可吸收外源DNA。 为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。;Ampr：氨苄西林抗性基因 – β内酰胺酶;结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 复制起始位点 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等;pET-32a Vector;pET-32 cloning/expression region;;材料、设备及试剂 ; 试剂 1、LB固体和液体培养基 LB培养基配方：（单位g/L） 胰蛋白胨 10 酵母提取物 5 NaCl 10 琼脂粉（1.5%） 15g （注：LB液体培养基不加琼脂粉） 按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121℃湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60℃左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100μg/ml,摇匀后用培养皿铺板。;2、Amp母液： 称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤器过滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20℃冰箱. 3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22μm滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于4℃冰箱储存 . 4、 pET32a-SmPR10质粒：实验室自制;操 作 步 骤;（二）、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1、将菌液转入1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃、4000rpm离心10分钟。　 2、弃去上清,用预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置10分钟后,4℃、4000rpm离心10分钟。 3、弃去上清,加入0.1ml预冷的0. 1mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞。每份100μl（注意悬液密度要均匀）,冰上放置备用。　 4、暂时不用的感受态细胞可置于 -80℃保存。;（三） 重组质粒DNA的转化 质粒和感受态细胞混和：在100μl感受态细胞悬液中加入5μl重组质粒DNA（ pET32a-SmPR10 ），轻轻混匀后冰上放置30分钟。 热击：42℃水浴中热击60秒（注：精确计算时间，热击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷2-5分钟。 复苏：向每管中加入800μl LB液体培养基(注：不含Amp),混匀后在37℃150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。;（四）涂布平板筛选转化质粒 将管中培养液摇匀后取100μl 均匀涂布于含Amp的筛选平板上。 （注：将培养液摇匀后涂布。） 2. 正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃温箱中培养过夜，次日观察实验结果。;预期实验结果;实验报告;实验中要考虑的重要因素; 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降??。10ng的cccDNA即可使100μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2 等均需是高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心