大肠杆菌耐喹诺酮类机制分子生物学基础的初步研究探究资料.pptVIP

大肠杆菌耐喹诺酮类机制分子生物学基础的初步研究 深圳南山人民医院传染科（518052） 邓启文 引言 随着氟喹诺酮类药物在临床的广泛应用，其耐药菌株日益增多。氟喹诺酮类的作用的靶位是细菌的DNA回旋酶。为了了解大肠杆菌对其耐药的分子生物学机制，我们对6株耐药菌1株敏感菌和1株标准株（ATCC25922）的gyrA基因的N末端编码区进行了PCR-SSCP及序列测定分析以检测gyrA基因突变。 材料和方法（1） 菌株的收集 4株大肠杆菌耐药菌株及1株敏感株来自我院院感科及检验科，其中3株来自尿液标本2株粪便培养标本。均经过常规生化及血清学鉴定。大肠杆菌标准株ATCC-25922购自中国药品生物制品检定所。 材料和方法（2） 药敏试验 诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星药敏纸片购自浙江省军区后勤部卫生防疫检验所。药敏试验采用Kirby-Bauer法，结果按NCCLS1993年版标准制定。 材料和方法（3） 主要试剂 扩增DNAgyrA两条外引物为：5’-GAGGAA GAGCTGAAGAGCT CCT-3’及5’CCGGTAC GGTACGGTACGGTAAGCTTCTTCAA-3’分别位于gyrA40—61位碱基及686—707位碱基，两条内引物为5’-TCCGTCGCCTACTTT ACGCC-3’及5’-TCGGCGAAATCGACCG TC-3’分别位于gyrA133-152位碱基及420-439位碱基。 材料和方法（3）续 上述引物委托上海生物细胞研究所DNA合成部合成。合成仪为Beckman Oli- go1000型。dNTP、Tag酶、Wizard聚合酶链反应产物纯化试剂盒购自北京华美公司。DNA测序试剂盒为Perkin-Elmer之末端标记试剂盒。胰化蛋白胨酵母浸膏、NaCl、琼脂糖、甲醇、甲醛、乙酸、重铬酸钾、硝酸银、酚、氯仿等为国内分析纯试验。 材料和方法（4） PCR扩增gyrA 按参考文献（1）方法。1ml过夜培养大肠杆菌10000×g，5min收集沉淀，加入200ulTE缓冲液（PH8.0）混悬，加入溶菌酶37℃温浴。10%SDS 37℃30min，蛋白酶K56℃水浴1h后，用等量酚，氯仿抽提后作模版DNA。 材料和方法（4）续 第一次PCR反应体积50ul，含10×PCR缓冲液5ul，MgCl22ul，dNTP2.5ul，Tag酶2u，模版2ul，外引物各50pmol（2ul），第二次PCR50ul反应体积中含第一次PCR产物1ul、内引物各2ul，余同第一次PCR反应体积。PCR条件：94℃预变性5分钟；94℃1分钟，56℃1分钟，72℃45秒，共35个循环。反应结束后72℃延伸10分钟。PCR仪为美国Perkin-Elmer公司的PE480热循环仪。 材料和方法（5） ? GyrAPCR产物的单链构象多态性（SSCP）分析： 取第二次PCR产物5ul，94%去离子甲酰胺和溴酚蓝各5ul混匀后置85℃水浴变性5分钟，然后迅速放入0℃冰水中使DNA处于单链状态。 材料和方法（5）续 配制5%聚丙烯酰胺凝胶（内含5%甘油），取1.5ul变性混合物上样。0.5×TBE为电泳缓冲液，15℃电泳。取出凝胶后在无离子水中浸泡30分钟后：①50%甲醇，12%乙酸10分钟；②10%甲醇，5%乙酸10分钟；③3.4mmol/L重铬酸钾；3.2mmol/L硝酸5分钟；④1.2 mmol/LAgNO320分钟，0.28 mmol/L碳酸钠，0.5ml/L甲醛5分钟后终止反应。观察结果。 材料和方法（6） PCR产物测序 利用WizardPCR产物纯化试剂盒，按产品说明纯化gyrA产物，纯化产物后以外引物为引物，用末端标记测序试剂盒在自动测序仪上进行测序。 结果 （1）GyrAPCR扩增结果 Gyr第一次PCR扩增产物为668 Vpb片段；第二次为307 bp片段（图1） 结果（2）GyrA PCR-SSCP结果（图2）  标准株及临床分离敏感株gyrA PCR-SSCP结果两条DNA单链处于同一位置。4株耐药菌株其结果与临床敏感株及标准株DNA单链结果不同，说明有碱基变异存在。 结果（3）DNA测序结果及推定氨基酸序列 （1） A株在gyrA基因碱基序列的第259位有G→A突变，致Asp-87→Asn。第267位有T→C突变，为无意突变。B株在247，259，300，332，552位分别有C→T，G→A，T→C，T→C，C→A突变，其中247位致Ser-83→Leu，259位致Asp-87→Asn，552位致His-184→Asn（