梅毒螺旋体粘附素Tp0751重组菌影制备与免疫活性的初步研究-基础医学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 梅毒螺旋体黏附素 Tp0751 重组菌影制备 与免疫活性的初步研究 论文作者签名: 指导教师签名: 论 文 评 阅 人 1 ： 张 艳，教授，硕导，南华大学 评阅人 2： 胡四海，教授，硕导，南华大学 答辩委员会主席： 肖建华，教授，博导，南华大学 委员 1： 朱翠明，教授，硕导，南华大学 委员 2： 杨秋林，副教授，硕导，南华大学 委员 3： 赵飞骏，教授，硕导，南华大学 委员 4： 刘双全，副教授，硕导，南华大学 答辩日期： 2015 年 5 月 24 日 南华大学学位论文原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学 位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文 中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 年 月 日 南华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文是本人在南华大学攻读（博/硕）士学位期间在导师指导下完成 的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它 单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部 或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保留学位论文；学校可根据国家或 湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位 论文全文数据库》，并按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定 享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到《中国学 位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论 文，解密后适用该授权。 作者签名： 年 月 日 导师签名： 年 月 日 梅毒螺旋体粘附素 Tp0751 重组菌影制备 与免疫活性的初步研究 摘要： [目的]构建重组梅毒螺旋体(Tp)黏附素 Tp0751 的大肠埃希菌菌 影(EBG)(rTp0751-EBG)，检测其免疫活性，为深入探讨其在抗 Tp 感 染中的潜在免疫保护作用奠定基础。[方法](1)EBG 的制备与鉴定：将 含有噬菌体 PHiX174 裂解基因 E 的质粒 pHH43 转化入 E. coli DH5α， 温控诱导使其形成 BG 并计算裂解效率，琼脂糖 DNA 电泳和透射电 镜(TEM)鉴定。(2)膜锚定载体的构建与表达：PCR 扩增膜锚定基因 E(含 linker)，与 pET28a-Tp0751 构建膜锚定载体 pET28a-E-Tp0751， 转化 E. coli BL21 诱导表达， WB 鉴定 E-Tp0751 的表达。 (3) rTp0751-EBG 表达质粒的构建：将含裂解基因盒 E-box 的 pHH43 与 pET-32a 质粒酶切、连接，构建重组质粒 pET32a-E-box，再将其 pET28a-E-Tp0751 构 建 重 组 表 达 质 粒 pET-28a-E-Tp0751-E-box 。 (4)rTp0751-EBG 表达与鉴定：将 pET28a-E-Tp0751-E-box 转化 E. coli BL21，28℃诱导表达 Tp0751，升温至 42℃热诱导裂解，计算裂解率。 WB 鉴定 Tp0751 的表达；TEM 鉴定 BG。(5)动物免疫：分别用 rTp0751-EBG 肌注、rTp0751-EBG 鼻滴、rTp0751 肌注(加弗氏佐剂)、 EBG 肌注及 PBS 肌注途径免疫 C57BL/6 小鼠 3 次。每次免疫前及末 I 次免疫后第 10d 收集血清和生殖道灌洗液，末次免疫后第 10d 制备小 鼠脾细胞。(6)rTp0751-EBG 免疫活性测定：用间接 ELISA 法检测血 清特异性抗体 IgG 抗体及生殖道灌洗液中 sIgA 抗体水平，CCK-8 法 检测 rTp0751 刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，间接 ELISA 检测 IFN-γ 表达 水平。[结果](1)EBG 制备与鉴定：42℃下 pHH43 上 E 基因被激活导 致 E. coli 裂解形成 BG，裂解率可达 98.13%；琼脂糖凝胶电泳未观察 到 DNA 条带，TEM 显示绝大部分细菌都裂解成空泡状并保持细菌基 本形态。(2)膜锚定载体的构建与表达：PCR 扩增出大小约为 180 bp 左右的片段，与膜锚定基因 E一致；SDS显示一分子量约 28 KDa 的可溶性蛋白，WB 显示该蛋白仅与 Tp 感染兔血清反应。 (3)rTp0751-EBG 表达质粒的构建、表达与鉴定：酶切及测序结果表 明含有目的基因