溶菌酶结构特点及分离纯化的研究.docVIP

溶菌酶结构特点及分离纯化的研究 扌商要：木文对溶菌酶的结构特点和作用机制做了简单介绍，并对近年来溶菌酶 分离纯化的方法，如结晶法、离子交换法、亲和层析法、膜处理技术、反胶团萃 取法等进行了综述。 关键词：溶菌酶、结构特点、作用机制、分离纯化 1 前言 溶菌酶(lysozyme;EC3. 2. 1. 17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶, 溶菌酶(lysozyme) 乂称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 (N-acetylmuramideglycanohydrlase),是一种能水解致病菌屮黏多糖的碱性酶。 人们对溶菌酶的研究始于木世纪初，英国细菌学家弗莱明(Flem ing)在发现 青霉素的前6年仃922年)发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶，因 其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶。在自然界屮，溶菌酶广泛存在于人体多种组织 中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁体液、木瓜、大 麦、无花果和卷心菜等植物中以及微主物中也含此酶叫其中以蛋清含量最为丰 富，约0.3%⑵。 2溶菌酶的结构特点和作用机制 2. 1溶菌酶的类型 溶菌酶按其所作用的微牛物不同分为两大类，即细菌细胞壁溶菌輛和真菌细 胞墜溶菌酶。细菌细胞壁溶菌酶有两种，一种是作用于B-1. 4糖甘键的细胞壁溶 解酶，另一种是作用于肽“尾”和酰胺部分的细胞壁溶解酶。真菌细胞壁溶菌酶 包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶⑶。 2.2溶菌酶的结构 鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶，它由18种129个氨基酸残基组成 的单肽链蛋白质，在分子屮的4对含硫氨基酸Cys间形成4个S-S键。Ph订lips 等人1956年用X射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构，溶菌酶分了近椭 圆形,大小为4. 5nmX3. 0nmX3. Onm,其构象复杂,a螺旋仅占25%,在分子的一 些区域有伸展着的B片层结构,研究表明溶菌嗨的内部几乎都为非极性的，疏水 的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用，其分了表面有一个容纳多糖底 物6个单糖的裂隙，这是溶菌酶的活性部位。 2. 3溶菌酶的性质 溶菌酶是一种碱性球蛋白，等电点高达10.7?11.0,分了内有4个二硫键交 联，化学性质非常稳定，对热也极为稳定，作用的最适温度为45?50°Co当pH值 在1.2?11. 3范围内剧烈变化吋，其结构几乎不变；在酸性环境屮，溶菌IW对热 的稳定性很强,pH4?7, 100°C处理lmin仍能保持原酶活性;pH3时能耐100°C加 热处理45mino目前了解最清楚并投入商业化生产的是鸡蛋蛋清溶菌酶，其分子 量为14000,等电点为11. 1,最适溶菌温度为50°C,最适pH为7,鸡蛋蛋清溶菌酶 化学性质非常稳定，在PH4?7的范围内，100°C处理lniin仍保持原酶活性，但在 碱性环境中该酶对热稳定性较差⑷。在干燥条件下溶菌酶可以长期在室温下存放, 其纯品为白色或微黄、黄色的结晶体或无定形粉末、无臭、味甜，易溶于水，遇碱 易破坏，不溶于丙酮和乙醯等㈤。 2.3作用机制 溶菌酶具有分解细菌细胞壁中肽聚糖的特殊作用。细菌的细胞壁由胞壁质组 成，胞壁质是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylalucosamine) N-乙酰胞壁酸 (N-acetylmuramic acid)交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为 肽聚糖(Pep tidoglycan)o多糖以直链形式存在，彼此邻近的多糖链之间可以通 过肽链部分相互连接，从而形成三维结构。酶的活性屮心是天门冬氨酸和谷氨酸， 溶菌酶通过It肽键屮第35位的谷氨酸和第52位的天门冬氨酸构成的活性部位水 解破坏组成微生物细胞壁肽聚糖分子的N-乙酰胞壁酸(NAM)N-乙酰葡萄糖氨 (NAG)之间的B-1,4糖甘键，使细胞因渗透压不平衡引起破裂，从而导致菌体细 胞壁溶解而起到杀死细菌(尤英是球菌)的目的叭 图1溶菌酶催化水解NAM及NAG间的糖背键 3溶菌酶的分离纯化方法 随着各种新的生物分离技术的出现，用于溶菌酶分离纯化的方法也愈来愈多, 从最初的直接结品法，沉淀法到亲和色谱法、离子交换法，特别是现在采用的新技 术如亲和膜色谱、反胶I才I萃取、双水相萃取⑺、亲和沉淀等。 3. 1结晶法 1946年Aiderton报道生长岀四方晶系的溶菌酶品体。后来,Pusey⑻用接 种法测量了溶菌酶溶解度随温度的变化,Rosenberger191用配液法测量了溶菌酶 溶解度和pH值的关系。在此基础上,Howard[,01测定了不同NaCl浓度下溶菌酶 的溶解度。20世纪80年代初，人们已经得到溶菌酶溶解度随温度、pH值变化的 三维曲面图。 结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法，其提取的原理是利用溶菌酶耐温、 耐酸及在盐溶液中稳定性