糖组学方法对比.pptxVIP

研究方法糖组学主要分为三大部分:结构糖组学 “糖捕获”技术 前沿亲和层析技术功能糖组学 微阵列技术生物信息学结构糖组学——糖捕获”技术提取糖蛋白糖肽释放糖肽分离糖肽纯化糖肽的鉴定技术流程提取糖蛋白（SLAC法）SLAC：凝集素亲和层析原理：植物凝集素（如刀豆素 A ）是一类能选择性结合糖链的糖结合蛋白，利用该特性可特异性富集某种糖蛋白或糖链。方法：根据不同糖蛋白类型，将不同的凝集素亲和柱串联排列，样品混合物依次经过这些亲和柱，将不同的糖蛋白或糖链富集在不同柱中，或用分离的不同凝集素柱进行纯化。缺点：只针对具备特定结构的糖链。刀豆素 A②糖肽释放（酶解法）利用特异性的内切酶在复合糖的特异部位进行切割获得所需糖链。常用于 N-糖链解离的酶有肽 N-糖苷F(PNGase F)、糖肽酶A。PNGase F③分离糖肽（SLAC法） 靶分子糖肽可通过与上述相同的凝集素亲和层析柱从经过消化的混合物中分离出来。（层析前最好保证蛋白酶完全失活 ,否则已固定的凝集素常由于暴露于高活性的蛋白酶中而受破坏）④糖肽纯化（ HPLC法）高效液相色谱法：上一步获得的糖肽有数 10 种,为了进行更为完全的分离,可采用反相或双相 HPLC 与不同类型的柱联合应用,这样具有更高的分辨率。⑤糖肽的鉴定基本研究策略：初步建立糖组数据库 数据库至少包括 4 个重要参数：编码核心蛋白的基因糖肽的分子量 砒胺化寡糖在二维图谱的位置系列凝集素的解离常数 主要研究方法： 序列分析、质谱及解离常数测定。糖捕获”技术用途：对某细胞和机体进行较全面的糖组学研究优点: 准确捕获目的糖肽，并保护糖肽结构不足：几乎没有特异性识别释放O-糖链的酶，所以不能应用于 O-糖肽。用凝集素收集糖肽, 糖肽的种类会受到限制。前沿亲和层析技术 在样品浓度不变的情况下 ,将过量体积的样品(如荧光标记糖肽)连续地加入凝集素柱中,再利用电喷雾电离质谱或荧光进行检测该层析法可与 HPLC 系统的联用优点：测定解离常数值的最佳方法,方便、敏感、高效,能有效分析蛋白酶、核酸酶以及凝集素之间的相互作用。结构糖组学基本研究策略糖蛋白提取与分离纯化糖链释放糖链分离纯化糖链结构解析糖蛋白提取与分离纯化利用糖蛋白特有的性质将糖蛋白与非糖蛋白进行分离。提取方法：有机溶剂萃取等分离纯化方法有：透析、超滤、层析（SLAC法）② 糖链释放化学释放：范围广，可释放O-糖链和N-糖链,但反应剧烈，可能破坏糖链结构。酶释放：反应温和，几乎不破坏糖链结构。但目前只适用于释放N-糖链。③糖链分离纯化层析法：包括柱层析，亲和层析等。电泳法：不同性质的糖链用对应的不同电泳方法分离④糖链结构解析A.基于DNA测序仪的荧光糖电泳可得到相应糖分子信息B.用于糖链结构解析的质谱分析方法可直接对样品进行 离子化和解析作用获取信息。C.核磁共振技术可确定糖链的构型连接位置分支等立体结构，但测定糖的讯号峰重叠严重，灵敏度不高。功能糖组学微阵列技术:微阵列技术是许多微型化学反应区域的集合,将数以千计的寡糖序列以点阵形式固定在特定的基板上,并通过高通量扫描技术分析糖分子与其他生物分子间的特异性相互作用 ,研究聚糖在生物体中的功能和作用机制。具高通量性和敏感性应用：识别糖与蛋白质间的相互作用, 如寻找抗生素治疗的新靶点以及进一步研究细菌的耐药机制。微阵列技术类型①单糖或二糖微阵列将单糖以及 3 种二糖通过异化 Michael 反应结合于玻璃表面 ,再通过荧光标记的植物凝集素特异性显示糖与蛋白质间的相互作用。特点：过程高效, 无须辅助试剂,且对湿度及溶液有一定程度的耐受连接方式：共价连接固定、还原胺基化，酰胺化固定等 糖的共价连接固定化方法微阵列技术类型②多糖微阵列多糖和糖蛋白固定于硝化纤维素包被的玻璃板特点：固定的效果取决于分子量的大小 ,分子量较大的更易固定, 可应用于细菌多糖的抗原性分析 连接方式：非共价吸附使用载体：载体主要有两类,一类是硝酸纤维素膜 ,另一类是具有粗糙表面的相对疏水的聚苯乙烯膜 。微阵列技术类型③寡糖微阵列将寡糖连接在酯链上 ;这些新生糖脂以及糖基化神经酰胺能固定于硝酸纤维素膜 , 并可筛选出糖蛋白配体;之后利用薄层层析和质谱来鉴定配体成分的序列特点：应用寡糖链来筛选能与其相互作用的配体检测通量和灵敏度仍不能充分满足后基因组学所需要的水平。连接方式：非共价吸附 新糖脂非共价吸附固定化方法生物信息学糖生物信息学数据库;糖生物信息学发展到一定阶段，对糖组学等研究中产生的数据进行专门储藏与查询的应用工具． 目前国际互联网中存在近百个糖生物信息学相关数据库，涉及内容包括糖链结构、参与糖链合成的基因或者蛋白质、糖结合蛋白、代谢通路、糖链或相互作用蛋白质等分子三维结构，或糖组学实验结果等领域．网络工具及数据库：CFG：涵盖了糖生物信息学数据库KEGG：