黄芩苷对热应激下牛睾丸支持细胞的抗凋亡作用-临床兽医学专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 （保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导 师 签 名 ： 时间： 年 月 日 青岛农业 青岛农业大学硕士学位论文 摘要 黄芩苷对热应激下牛睾丸支持细胞的抗凋亡作用 摘 要 黄芩苷（baicalin）具有清热镇静、抑菌抗炎等作用。本实验通过对热应激下SCs添 加不同浓度黄芩苷探讨黄芩苷是否可以提高热应激下 SCs 的存活率以及提高SCs干细 胞因子（SCF）和胶质细胞源性神经生长因子（GDNF）的表达，并且探讨其是通过什 么途径提高细胞抗凋亡作用。试验一，采用二步酶消化法分离睾丸组织，4 h差速贴壁纯 化获得睾丸支持细胞，分别用RT-PCR鉴定标志性基因SCF和GDNF的表达，免疫组化染 色检测FasL表达，福尔根染色（Feulgen）鉴定细胞形态。试验二，选用第三代对数生长 期的SCs，通过MTT筛选黄芩苷安全使用浓度；设对照组（34℃），热应激组（43℃）， 热应激加黄芩苷（0.1，1，10和20 μg/ml）组；用 MTT 检测细胞存活率（A值），提取 各组细胞总RNA和总蛋白，分别用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）和酶联免疫吸附测 定（ELISA）检测SCF和GDNF mRNA及其蛋白的表达。试验三，流式细胞仪检测热应 激下细胞凋亡率。分别用qRT-PCR和Western blot检测Fas，FasL，caspase 8和3以及Hsp72 mRNA和蛋白的表达。Caspase 3活性试剂盒检测caspase 3的活性。 结果显示，试验一：第三代原代细胞生长良好，RT-PCR检测可见SCF与GDNF mRNA 表达，特异性蛋白FasL表达明显，福尔根染色显示有卫星核小体存在，表明分离培养的 细胞为睾丸支持细胞。试验二：对第三代SCs进行热应激处理，与对照组比较，43℃热 应激组细胞存活率极显著(P0.01)降低，SCF与GDNF mRNA与蛋白的表达显著降低。添 加不同浓度黄芩苷（0.1, 1, 10, 20 μg/ml）后，与43℃热应激组比较，细胞的存活率显著 升高，SCF 和 GDNF mRNA (P0.01)和蛋白(P0.05)的表达量均显著升高。试验三：43℃ 热应激通过激活Fas/FasL凋亡路径并激活下游caspase 3诱导细胞发生凋亡。添加不同浓 度黄芩苷（0.1, 1, 10, 20 μg/ml）后发现，与43℃热应激组相比，细胞凋亡率极显著降低 （P0.01），Fas，FasL，caspases 8和3 mRNA表达显著下降，Fas，FasL蛋白表达量显 著下降，pro-caspases 8和3蛋白表达量显著增高。Hsp72 mRNA与蛋白表达显著增高，在 浓度1 μg/ml 黄芩苷热应激组Hsp72 mRNA水平极显著增高 (P0.01)，在浓度10 μg/ml 的黄芩苷热应激组Hsp72蛋白表达水平呈极显著增高（P0.01）。 本实验发现，热应激诱导睾丸支持细胞发生凋亡，降低其SCF和GDNF的表达。添 加黄芩苷能提高热应激下睾丸支持细胞的存活率以及SCF和GDNF的表达量，可通过调 节Fas/FasL凋亡通路，caspase 3活性以及Hsp72表达提高SCs抗凋亡能力。 关键词：热应激；睾丸支持细胞；黄芩苷；生长因子；细胞凋亡；热休克蛋白72 青岛农业 青岛农业大学硕士学位论文 Abstract Protective Effect of Baicalin on Heat Stress-induced Apoptosis of Bovine Sertoli Cells Abstract Heat stresses-induced bovine sertoli cells (SCs) apoptosis caused stem cell factors (SCF) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) expres