养殖大鲵肠道细菌多样性-江苏农业科学.PDFVIP

— １４６— 江苏农业科学　２０１９年第４７卷第１期 兰阿峰，郭素芬，彭　浩，等．养殖大鲵肠道细菌多样性［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（１）：１４６－１５１． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．０１．０３５ 养殖大鲵肠道细菌多样性 １，２，３ １ １，２ １ １，２ 兰阿峰 ，郭素芬 ，彭　浩 ，刘　栋 ，邓百万 （１．陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西汉中７２３００１；２．陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中７２３００１； ３．陕西理工大学大鲵研究所，陕西汉中７２３００１） 　　摘要：纯培养分离大鲵肠道细菌，选用细菌通用引物进行１６ＳｒＲＮＡ扩增，测序后提交序列并分析；免培养方法采 用试剂盒提取肠道内容物总ＤＮＡ，选用细菌通用引物对总ＤＮＡ进行１６ＳｒＲＮＡ扩增，构建克隆文库，对阳性克隆进行 ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析，用Ｈａｅ 内切酶进行片段插入性验证并进行测序，构建系统发育树。纯培养获得１０３个菌株，分属 Ⅲ 于１６个不同的可操作分类单元（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｔａｘｏｎｏｍｉｃｕｎｉｔｓ，ＯＴＵｓ），系统发育分析表明这些克隆序列分别属于变形菌 门（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）和放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）。其中，变形菌门（占克隆总数 ８７．６３％）为最优 势类群。免培养结果将随机挑取的１０５个阳性克隆归为１５个ＯＴＵｓ，系统发育分析表明这些克隆序列分别属于变形 菌门（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、厚壁菌门（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、放线菌门（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）和拟杆菌门（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）４个门。其中，变形 菌门（占克隆总数的７１．４３％）为最优势类群。养殖大鲵肠道细菌多样性丰富，具有进一步开发研究的价值。 　　关键词：养殖大鲵；肠道细菌；纯培养；免培养；多样性 　　中图分类号：Ｓ９６６．６　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１９）０１－０１４６－０６ 　　中国大鲵（Ａｎｄｒｉａｓｄａｖｉｄｉａｎｕｓ）别称“娃娃鱼”，属于两栖 ２种方法对养殖大鲵的肠道微生物多样性进行研究，以期为 纲有尾目隐腮鲵科，是现存个体最大的两栖动物，１９９８年被 大鲵保护工作提供理论依据。 ［１］ 列为国家二级保护动物 。我国大鲵主要分布在陕西、江 ［１－３］ １　材料与方法 西、湖北、四川等 １７个省（区）深山峡谷的溪流当中 。中 国大鲵是肉食性捕食动物，野生大鲵捕食的动物有螃蟹、昆 １．１　材料 ［４－５］ 虫、青蛙、鱼等 。由于大鲵具有极高的经济价值和药用价 １．１．１　供试材料　养殖大鲵采自陕西理工大学大鲵研究所 值，其人工养殖逐渐得到了重视，目前在陕西汉中、四川巴中 大鲵养殖室，样本共 １０条，平均体质量６．７６ｋｇ，解剖后取完 等地区出现了较大规模的养殖。 整消化道放入４℃的冰箱中保存，２周内处理完。 动物肠道寄生着大量的微生物，这些微生物同时也是动 １．１．２　主要仪器　超净工作台（江苏苏州净化设备有限公 物体的组成部分，肠道微生物与寄主消化吸收及健康状况密 司），高压灭菌器（美国Ｓｔｉｋ公司），凝胶扫描成像系统（美国 ［６－８］ 切相关 。肠道是一个相对密闭的系统，其内部生长的微 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），ＰＣＲ扩增仪（英国Ｔｅｃｈｅｎ公司），高速冷冻 生物以厌氧或兼性厌氧的微生物为主，采用传统的培养方法 离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），移液器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），恒 分离依然是肠道微生物研究的主要方法之一，有报道称传统