慢病毒介导STMN1基因沉默对白血病K562细胞及其耐药株生物学特性影响及机制分析-内科学(血液病)专业毕业论文.docxVIP

PAGE PAGE 4 慢病毒介导 STMN1 基因沉默对白血病 K562 细胞及其 耐药株的生物学特性影响及机制研究 博士研究生：徐建萍 导 师：胡建达 教授 摘 要 Stathmin 是一种广泛存在于胞质中、高度保守的磷酸化蛋白，分子量 19kDa， 由定位在人类染色体 1p36.1 上 STMN1 基因编码产生的。由于被不同的实验室独 立发现，因此又称为 op18、p18、p19、metablastin、pp20 等。这里用 Stathmin 表示蛋白，STMN1 表示基因。Stathmin 作为一种微管解聚蛋白，通过作用于微 管蛋白，调节微管动力、纺锤体形成进而影响细胞周期，改变细胞的增殖、分化、 凋亡、迁移等生物学行为。其功能紊乱会产生持续的微管组装及无法控制的细胞 周期，导致肿瘤形成。研究证实 Stathmin 在多种人类肿瘤细胞中呈高表达，参与 肿瘤发生、发展的重要信号转导分子。 最近兴起的 RNA 干扰（RNA interference, RNAi）技术，以其快速、简便、 高效的抑制基因表达受到了极大的关注，是目前研究基因功能最有效的方法之 一。研究表明，利用 RNAi 技术可同时封闭多个癌基因，对诱导肿瘤细胞凋亡、 抑制其增殖和远处转移具有重要的意义。 本课题首先采用荧光差异显示的双向凝胶电泳（two dimensional difference in gel electrophoresis，2D-DIGE）比较敏感和耐药的 K562 细胞株的全蛋白质表达 谱，质谱分析获得差异蛋白质的肽质量指纹图谱及生物信息学分析进行差异蛋白 质鉴定，获得候选的相关蛋白，挑选其中表达上调的 Stathmin，进行相关研究。 应用蛋白印迹技术（Western blot）验证不同白血病细胞株（CA46、CEM、 NB4、Jurkat、U937、敏感及耐药的 HL-60 和 K562 细胞）Stathmin 蛋白表达， 并以正常对照组和临床经 MIC 分型确诊的初治、缓解、复发的白血病患者为研 究对象，应用蛋白印迹技术和实时荧光定量 PCR 技术（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR）从蛋白质和基因水平检测分析 Stathmin 表达，分析其在急性白血病发生发展及微残留白血病判断中的作用。最 后应用 RNAi 技术下调 STMN1 基因，研究其对 K562 及耐伊马替尼的 K562/G01、 耐阿霉素的 K562/A02 等白血病细胞株增殖、凋亡等生物学特性的影响及机制探 讨。 一、白血病 K562 细胞及其耐药株的差异蛋白质组分析 应用蛋白质组学方法比较白血病细胞株 K562 细胞及其耐阿霉素 K562/A02 细胞蛋白质表达谱的差异，筛选新的耐药相关蛋白。 方法：1．利用荧光差异双向电泳（DIGE）技术分离 K562 及 K562/A02 细 胞的总蛋白，用 MALDI 串联飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF）对差异表达的 蛋白质点进行鉴定，搜索蛋白质数据库，获得差异蛋白质的信息。2．用蛋白印 迹技术和实时荧光定量 PCR 技术从蛋白质水平和 mRNA 水平对差异蛋白质进行 验证。 结果：1．经过初步筛选和质谱分析，鉴定出 8 个表达差异的蛋白质，其中 2 个表达下调，6 个表达上调，分别参与细胞能量代谢、细胞增殖、细胞凋亡、 细胞信号转导和基因转录等。2．挑选其中表达上调的蛋白 Stathmin 和 CrkL，其 蛋白印迹实验结果与双向电泳结果一致，但实时荧光定量 PCR 显示 Stathmin 的 mRNA 水平变化与蛋白质水平变化无一致性。 二、Stathmin 在急性白血病中表达的研究 应用蛋白印迹技术和实时荧光定量 PCR 技术检测 Stathmin 在急性白血病中 表达的情况，希望为急性白血病诊断和微残留白血病的判断提供新的生物学指 标。 方法：1．收集正常人（25 例）及临床经 MIC 分型确诊的急性白血病初治、 缓解和复发患者外周血或骨髓标本（76 例），分离单个核细胞后，分别提取总 RNA 和总蛋白。2．应用蛋白印迹技术和实时荧光定量 PCR 技术检测分析其在 正常人、急性白血病初治、缓解和复发患者中表达的差别。 结果：1．Stathmin 蛋白在正常人中不表达，其 mRNA 在正常人中低水平表 达。2．Stathmin 蛋白和 mRNA 在急性白血病初治患者中高水平表达，与正常人 相比具有统计学意义（P＜0.05），治疗缓解的患者 Stathmin 蛋白表达明显减弱或 不表达，复发患者该蛋白和 mRNA 又恢复高表达，且 mRNA 表达水平高于初治 者（P＜0.05）。 三、慢病毒介导的白血