绵羊Myostatin基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定-预防兽医学专业毕业论文.docxVIP

关于学位论文原创性和使用授权声明 本人所成交的学位论文，是在导师的指导下，独立进行科学研究 所取得的成果，对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的 个人和集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分论文编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其它复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》并向社 会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导 师 签 名： 日 期： PAGE PAGE 10 引 言 动物转基因技术是将外源基因移入动物细胞并整合到基因组中，从而使其 得以表达。自从 Gordon 等（Gordon et al, 1980）利用显微注射法建立转基因小鼠 以来，该技术在分子生物学、分子遗传学、分子免疫学、肿瘤工程学、医学及畜 牧学等研究领域显现出无限广阔的应用前景（Chisari F V et al, 1985）。其中利用 动物转基因技术进行动物新品种的培育以及通过建立转基因动物制作生物反应 器是目前各国关注的热点。传统的转基因方法主要有三种，即 DNA 显微注射法、 逆转录病毒感染法及胚胎干细胞法，但是目前这三种方法制作转基因动物的效率 都还很低，且实验设备昂贵，操作复杂，从而导致生产成本过高（Wilmut I et al, 1997 ; Wakayama T et al, 1998 ; Wakayama T et al, 1998）。因此研究人员一直在 努力探索一种简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。 国内外的很多学者将目光投向了 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)技术。 RNAi 可以将基因的表达“敲除”，诱导细胞表现特定基因缺失，为人们迅速准 确的研究基因功能、基因之间的相互联系和相互作用提供了一个非常有用的工 具，因此现在越来越多的研究者将 RNAi 技术应用于转基因的研究中。 1 转基因动物研究进展 转基因技术自创立以来，各国学者一直在努力寻求技术上的改进，从而达到 简化操作，提高动物阳性率的目的。目前常用的转基因方法有以下几种：显微注 射法；胚胎干细胞法；体细胞、胚胎细胞克隆法；精子介导法；精原干细胞介导 法；录病毒感染法等。 1.1 显微注射法 1980 年，自 Gordon 等（Gordon et al, 1980）首次将显微注射技术用于小鼠 受精卵的基因导入以来，该技术已得到广泛应用，是目前世界上基因的转移效率 较好的一种方法，可直接用不含原核载体 DNA 片段的外源基因进行转移，外源 基因的长度可达 100kb。但一些不足也限制了这一技术的应用，如设备昂贵，操 作复杂；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主 DNA 片段缺失、重组等突变，会造成动物严重的生理缺陷，如跛蹄，大脑发育 不良，生殖能力丧失等。尽管如此，由于其直接对基因进行操作，整合率较高， 因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。 1. 2 胚胎干细胞法 胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES cells）是从胚泡内层细胞群衍生而来 的尚未分化的胚胎细胞，当将这些细胞注入另一囊胚期胚胎的囊胚腔时，它们很 容易与受体胚胎的囊胚细胞聚集在一起，并结合成为胚胎的一部分并参与其分 化。将外源基因导入 ES 细胞中，外源基因可能会整合到发育成个体的一部分组 织中去，并在组织中特异性表达。当 ES 被注入 X 期囊胚后可参与包括生殖腺在 内的各种组织嵌合体的形成，通常利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导 入 ES 细胞中，将有功能的外源基因整合到 ES 细胞基因组内的非必需基因位点， 经筛选培养，然后用于转基因动物的生产。胚胎干细胞是从早期胚胎的内细胞团 经体外培养建立的多潜能细胞系，它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化性 质，在体外培养时保持未分化状态，但在适当条件下可被诱导分化。 1984 年 Bradly 等（Bradly et al, 1984）首次证实体外培养的 ES 细胞能发育 形成生殖系嵌合体，经交配选种可获得纯合体后代。2001 年我国军事医学科学 院杨晓教授获得了国内首例 Smad2 条件性基因打靶小鼠（周江等，2001）。通过 逆转录病毒处理小鼠胚胎干细胞，得到稳定的整合。胚胎干细胞法与显微注射法 和慢病毒法相比的主要优点是：①在用外源 DNA 转染之后，胚胎干细胞可以被 克隆，继而可以筛选含有整合外源 DNA 的细胞用于细