实时荧光定量PCR原理.pdfVIP

实时荧光定 量PCR原理与 应用 提纲 •PCR •定量PCR •荧光化学监测物质 •实时荧光定量PCR应用 PCR 目的及背景  多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８ ０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操 作简便， 可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列 的拷贝.  分子克隆， 目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方 面得到了广泛的应用。  ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条 件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于 引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。 反应分三步：①变性 （denaturation）；②退火 （annealing）；③延伸 （ex tension）， 反应过程见图。 传统PCR 传统PCR 传统PCR 传统PCR 通过凝胶电泳对终产物进 行定性分析 (30 cycles) PCR: 理论vs. 实际 Theoretic • In theory, PCR reactions al amplify exponentially, t e increase doubling every cycle and g r grow forever. a Reali T g A ty o N L D • In reality, Cycle # 提纲 •PCR •定量PCR •荧光化学监测物质 •实时荧光定量PCR应用 定量PCR  通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 模板 F Cycle 1 F 2X 模板 F 本底期、指数扩增期、平台期 Cycle 2 Linear