基因编辑技术.pptxVIP

分子遗传学研究新技术;·;基因编辑;RNA引导的CRISPR/Cas核酸酶技术;CRISPR/Cas 系统的发现;CRISPR/Cas 系统作用机制;在CRISPR 位点附近, 存在一系列CRISPR相关(CRISPR-associated, Cas)基因，是一个较大的多态性家族, 编码的蛋白具有核酸相关的功能域。 CRISPR/Cas 免疫系统被分为三种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas 免疫系统需要多个Cas 蛋白形成复合体切割DNA 双链, 而Ⅱ型CRISPR/Cas免疫系统只需要一个Cas9 蛋白来切割DNA 双链,目前Ⅱ型系统是被改造的最为成功的人工核酸酶。体外实验证明Cas9基因是参与CRISPR免疫系统的唯一必需基因。 ;Cas9 是由1 409 个氨基酸组成的多结构域蛋白, 含有2 个核酸酶结构域：氨基端的RuvC-like 结构域及位于蛋白中间位置的HNH 核酸酶结构域, HNH 核酸酶结构域可以切割与crRNA 互补配对的模板链, 切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(PAM)上游3nt 处,RuvC-like 结构域可以对另一条链进行切割, 切割位点位于PAM 上游3~8nt 处。在crRNA 与tracrRNA 形成的双链RNA 的指导下（图a）, Cas9 蛋白对靶位点进行切割（图b）。 ;图a;图b;基于Ⅱ型CRISPR/Cas 系统, 科研工作者发明了一种便捷的基因组编辑技术, 该技术已经成功应用于大肠杆菌、肺炎双球菌、酿酒酵母、斑马鱼、小鼠细胞、小鼠、人类多种细胞系、果蝇、线虫、大鼠、水稻、小麦、拟南芥等（如表1）。 ; 注： NHEJ即非同源末端连接 HR即同源重组;TALEN介导的基因组定点修饰技术 ;TALEN的结构;? FokⅠ通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能,?因此,TALEN?通常是成对使用。;TALE蛋白的中部包含一段很长的、串联排列的重复序列,?这种重复序列为这一蛋白家族所独有,?是其DNA结合结构域的一个重要组成部分,?具有特异性识别并结合特异DNA序列的特性。 因此构建识别特定DNA序列的TALE（如表2）就成为这一技术中的一个关键步骤和TALE应用中的主要瓶颈。;表2 TALEN的构建;通过用户定制的TALEN随意改造复杂的基因组,?依然是TALE应用中最为吸引人的。毋庸置疑,?TALEN技术对基础研究、生物技术和人类基因治疗等诸多领域都会产生重大影响,?堪称基因组定点修饰技术的一场革命。它开辟了前所未有的方式来剖析任意物种的基因功能,?还可以在同一个细胞系上利用TALEN技术产生不同的遗传病模型,?为人类遗传病或后天的基因紊乱疾病开启了新的治疗途径。; TALENs 在基因组定点修饰方面具有广泛的研究和应用，然而,ZFNs和TALENs这两项技术在实施操作过程中技术难度较大、构建组装时间较长, 一般实验室很难得到有效利用。CRISPR/Cas 操作简单, 制作成本低, 适用于普通分子生物学实验室。与之前的基因定点改造技术ZFNs 及TALENs 相比, CRISPR/Cas系统具有显著优点：可以对任何后面紧随NGG(PAM)的20 bp的序列进行编辑; 能同时作用于多个靶位点; 此外, 载体构建简单,Cas9 基因是相同的, 针对特定基因位点只需要设计sgRNA, 而ZFNs 或TALENs 对每个基因位点编辑都需要设计和组装两个核酸酶, 所以CRISPR/Cas 系统更容易在实验室中得到推广和应用。 然而, 所有基因组定点编辑技术都存在一个不可避免的问题：对基因组非特异性位点随机切割造成脱靶效应(Off-target effects)。 ;That is all, thank you !