罗汉果甜甙对大鼠胚胎肢芽发育的影响-人体解剖与组织胚胎学专业毕业论文.docxVIP

邹聪聪遵义 邹聪聪 遵义医学院硕士学位论文 万方数据 万方数据 罗汉果甜甙对大鼠胚胎肢芽发育的影响 中文摘要 目的：探讨罗汉果甜甙对大鼠胚胎发育毒性，为罗汉果甜甙成为安全的天然食品甜 味添加剂的开发应用提供实验研究依据。 方法： 1.罗汉果甜甙含药血清的制备：选取20只SD雄鼠（体重220 g~260 g)随机分为4组， 每组5只。阴性对照组予以蒸馏水（1 ml/100g·BW)灌胃，实验3个组分别按罗汉果 甜甙0.5 g/kg·BW、1.0 g/kg·BW、5.0 g/kg·BW（即高、中、低）剂量连续灌胃4天， 1次/日，末次灌胃后1～1.5小时内制备含药血清。 2.大鼠胚胎肢芽细胞的培养：取大鼠 E14.5 肢芽制备细胞悬液。分别接种到 96 孔 和 24 孔培养板中，随机分为（低、中、高）剂量 3 个实验组、（阳性、阴性）2 个 对照组。3 个实验组及阴性对照组分别加入 10%培养体积的不同剂量罗汉果甜甙含药 血清及正常血清，阳性对照组加入维甲酸溶液（终浓度为 10 ug/ml）。体外培养 48h 后进行各项检测:(1)肢芽细胞的增殖与分化：MTT 法检测细胞增殖，阿利新兰染色 检测软骨细胞集落数及面积。(2)肢芽细胞凋亡率：以 Hochest 33258 染色后检测细 胞凋亡率。 3．大鼠胚胎肢芽器官培养：取大鼠 E14.5 肢芽，15 个 1 组移入直径 60mm 无菌组织 培养皿中，随机分为（低、中、高）剂量 3 个实验组、（阳性、阴性）2 个对照组。 参照肢芽细胞培养方法加入受试物。体外培养 48h 后收获各组肢芽进行检测：(1) 以 RT-PCR 方法测定各组 BMP-2 mRNA 及 Collagen ⅡmRNA 的表达。(2)以 Western Blot 方法测定各组 BMP-2 蛋白及 Collagen Ⅱ蛋白的表达。 结果： 1.罗汉果甜甙对肢芽细胞增殖、分化及凋亡的影响： (1)对肢芽细胞增殖的影响：各实验组均不同程度的促进了肢芽细胞的增殖，其 OD 值均大于阴性对照组，与之相比（P 0.05）均有显著性差异，以中剂量组最显 著；而阳性对照组明显抑制了肢芽细胞的增殖，与阴性对照组比有显著性差异（P 0.05）。(2)对肢芽细胞分化的影响：各实验组均不同程度的促进了软骨细胞分化， 其软骨细胞集落数与集落面积均大于阴性对照组，相比均有显著性差异（P 0.05）。 2 其中以低剂量组集落数最多、中剂量组集落面积最大，与其它实验组比也有显著性 差异（P 0.05）。而阳性对照组明显抑制了肢芽细胞的分化，与阴性对照组比有显 著性差异（P 0.05）。(3)对肢芽细胞凋亡的影响：实验中、低剂量组肢芽细胞凋 亡率低于阴性对照组，但只有低剂量组与阴性对照组比有显著性差异（P 0.05）。 阳性对照组、高剂量组肢芽细胞凋亡率高于阴性对照组，相比具有显著性差异（P 0.05），提示高剂量含药血清有促进大鼠胚胎肢芽细胞凋亡的作用。 2.罗汉果甜甙对肢芽器官 BMP-2 mRNA、Collagen ⅡmRNA 表达的影响: (1)在本实验高、中、低各剂量组中培养的肢芽器官中 BMP-2 mRNA 相对表达量 与阴性对照组数据相近，与其相比较均无显著性差异（P 0.05）。(2)CollagenⅡ mRNA 在实验低、中剂量组的相对表达量与阴性组比较无显著性差异（P 0.05）。 高剂量组比阴性对照组相对表达量高，比较有显著性差异（P 0.05）。 3.罗汉果甜甙对肢芽器官 BMP-2 蛋白、Collagen Ⅱ蛋白表达的影响: (1)在本实验实验低、中、高剂量组中培养的肢芽器官中 BMP-2 蛋白表达量与阴 性对照组比较均无显著性差异（P 0.05）。(2)Collagen Ⅱ蛋白的表达量在实验低 剂量组高于阴性对照组，比较有显著性差异（P 0.05）；中、高剂量组与阴性组比 较无显著性差异（P 0.05）。而阳性对照组肢芽器官的 BMP-2 与 Collagen Ⅱ蛋白 表达量均明显低于与阴性对照组，相比有显著性差异（P 0.05）。 结论： 1.本实验条件下罗汉果甜甙含药血清对体外培养肢芽细胞的增殖和分化均有促进作 用。低剂量组含药血清可以降低肢芽细胞凋亡率，而高剂量组则使肢芽细胞凋亡率 升高。 2.罗汉果甜甙各剂量组含药血清对体外培养整体肢芽器官的BMP-2 mRNA和BMP-2 蛋白表达均无影响。中、低剂量组含药血清对Collagen ⅡmRNA的表达和中、高剂 量含药血清对肢芽Collagen Ⅱ蛋白的表达均无影响，高剂量组含药血清对Collagen Ⅱ mRNA表达、低剂量对Collagen Ⅱ蛋白的表达有上调作用。 3.罗汉果甜甙含药血清对大鼠胚胎无致畸性、无发育毒性。 关键词