栝楼桂枝汤对器官型皮层脑片氧糖剥夺损伤后轴突再生的影响及机制研究-药理学专业毕业论文.docxVIP

2．3器官型皮层脑片制备及培养 2．3器官型皮层脑片制备及培养 13 2．4 OGD损伤模型的制备 14 2．5分组与给药 ．．14 2．6碘化丙啶荧光染色 ．14 2．7微量酶标法检测脑片乳酸脱氢酶释放量 14 2．8免疫组织化学法观察皮层脑片NF68蛋白的表达 ．14 2．9蛋白印迹法检测皮层脑片中Tau-1、GAP43蛋白的表达 ．15 2．10统计学处理 18 3．实验结果 ．．1 8 3．1栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片PI荧光强度的影响 18 3．2栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片的LDH释放量的影响 1 9 3．3栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片轴突再生作用的影响 ．．20 3。4蛋白印迹法检测皮层脑片中Tau-1、GAP43蛋白的表达 ．20 4．讨论 ．．：!：! 第三章栝楼桂枝汤对SD乳鼠皮层脑片OGD损伤后轴突再生影响的机制 研究 。25 1．实验材料 ．．25 1．1实验动物 25 1．2实验药物 ．．25 1．3实验试剂 25 1．4实验仪器 26 2．实验方法 ．．26 2．1供试品配制 ．26 2．2脑片培养液的配制 ．26 2．3乳鼠皮层脑片制备及培养 26 2．4 OGD损伤模型的建立 27 2．5分组给药 27 2．6实时荧光定量PCR法检测皮层脑片中Rho-ROCK通路相关基因的表达 ．．27 2．7蛋自印迹法检测皮层脑片中Rho-ROCK通路相关蛋白的表达 29 2．8统计学处理 。29 3．实验结果 ．．30 3．1栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片Nogo-AmRNA及蛋白表达的影响 ．．30 3．2栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片N出1 mRNA及蛋白表达的影响 ．．32 3．3栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片RhoAmRNA及蛋白表达的影响 。34 3．4栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片RoCKII mRNA及蛋白表达的影响 36 3．5栝楼桂枝汤对OGD皮层脑片CRMP2蛋白磷酸化的影响 38 4．讨论 ．．39 5．小结 ．．40 III 万方数据 结论 结论 ．．．．．．。。． ．．．。。．。．．．．．。．．．．。．．。．。．。。。．．．．。。．．。 。 。 ． 。．．．。 ．。。。。。．4l 参考文献 42 附两之 ． ． ． 48 附 图 ．49 致 谢 52 文献综述 53 作者简历 59 IV 万方数据 中文摘要目的：制备SD乳鼠器官型皮层脑片氧糖剥夺(Oxygen 中文摘要 目的：制备SD乳鼠器官型皮层脑片氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation，OGD) 损伤模型，观察栝楼桂枝汤(GLGZD)对器官型皮层脑片OGD损伤后的保护作用，进 一步探讨栝楼桂枝汤对皮层脑片OGD损伤后轴突再生的影响以及是否通过影响 Nogo．A蛋白及其受体以及由Nogo．A介导的Rho．ROCK通路，促进OGD后损伤轴突 的再生，从而为探讨栝楼桂枝汤改善脑卒中患者神经功能，促进脑卒中后神经功能康复 提供实验依据。 方法：按照Stopinni、HW Dong及Foehring改良法制备SD乳鼠器官型皮层脑片， 采用三气培养箱法复制器官型皮层脑片氧糖剥夺模型。(1)最佳造模时长的探索：将培 养14d的皮层脑片分为空白对照组、OGDl5min组、OGD30min组、OGD45min组、 OGD60min组，空白对照组不做任何处理。各OGD组吸弃脑片培养液后，加入lmL PBS， 置于94％N2、50％C02、1％02、37酌三气培养箱中分别孵育15rain、30 rain、45 rain、 60 min后，吸弃PBS，更换为lmL脑片培养液后，置于C02培养箱中继续培养。于OGD 前1 d、OGD后第1 d、第3 d分别收集各组脑片培养液，采用碘化丙啶(Propidium Iodide， PI)荧光染色法检测各组脑片损伤情况。采用微量酶标法，动态监测各组脑片培养液中 乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)释放量及累计释放量。(2)GLGZD对器官型 皮层脑片OGD损伤后轴突再生的影响及机制研究：将培养14d的皮层脑片分为空白对 照组、模型对照组、GLGZD低剂量组、中剂量组、高剂量组、阳性对照组，每组9片 脑片，按上述实验提示的最佳造模时长复制OGD模型，并给予相应的药物干预3d后， 收集样品，分别采用：①PI染色法检测脑片损伤程度；②微量酶标法检测脑片培养液 上清中LDH释放量；③免疫组织化学法标记脑片轴突特异性NF68蛋白，计算各组轴 突长度；OWestem blot法检测Tau．1、GAP43蛋白的表达情况，观察GLGZD对OGD 脑片损伤轴突再生的影响；ORT-qPCR法检测Nogo．A、NgRl、RhoA、ROCK II的mRNA 表达水平；West