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第十三章 生化与基因工程药物分析 电泳法、生物鉴定法 高凌波 2006.6.3 在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。电泳分离是基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的。 优点：灵敏度高、重现性好、检测范围广、操作简便并兼备分离、鉴定、分析等优点，已成为生物技术及生化药物分析的重要手段之一。 分类 根据电泳的分离特点及工作方式，可分为三大类： 1、自由界面电泳：在一根U形管里的溶液中，同种分子的构型及荷电情况基本一致，在电场影响下，逐渐密集而与其他电泳迁移率不同的物质之间形成明显的界面。 2、高效毛细管电泳（HPCE）：在一根内径约50μm的毛细管中，于高压电场下进行样品分离分析的一种新型电泳技术。 3、区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各自区带的电泳。 根据所用的支持物不同可分为：纸电泳法、醋酸纤维素薄膜电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)和十二烷基硫酸纳（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS) 。 常用电泳法的类型及其应用 1. 纸电泳法 纸电泳法是用滤纸作为支持介质的一种电泳法，其操作要点如下： （1）缓冲液的选择：应根据供试品的理化特性，需要的电泳速度和分辨力，选择适宜的缓冲液、pH值和离子强度。 （2）滤纸的裁剪：滤纸可按需要裁成与电泳槽相当的长方形或长条形，样点的间距为2～3cm，滤纸长度视电源输出最高电压及所需的电场强度而定，电压恒定时，所需场强越大，滤纸裁得越短。 （3）点样方法：分干点法与湿点法。干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干，再点，反复数次直到点完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿。干点法能浓缩供试品，适用于稀的供试品溶液。湿点法是将滤纸全部浸入缓冲液中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，滤纸点样部分需用架子架起，点的次数不宜过多，稀的供试品溶液应预先浓缩，其优点是可保持供试品的天然状态，点样后立即接通电源以免扩散。 （4）电泳及区带显示：将点好的滤纸放电泳槽上。控制电压、电流和电泳时间。电泳后，滤纸从槽中取出，晾干或烘干。不同的供试品采用不同的 显色方法，如核苷酸类药物可直接在紫外光灯下观察定位，而有些物质必须用显色剂显色。 （5）定量测定：纸电泳的定量方法与纸色谱的定量方法一样，可以用洗脱法或光密度计扫描法进行。但目前光密度计扫描法已被醋酸纤维素薄膜电泳法取代。这是因为在纸电泳法中，支持物滤纸对蛋白质样品的吸附力较大，且滤纸本身为极性物，透明化步骤较烦，不利于光密度计扫描法定量测定。 纸电泳法可用于蛋白质、核苷酸等生化药物的测定。如核苷酸，具有共轭双键的嘌呤或嘧啶碱基，在一定的pH条件下，具强紫外吸收，电泳后滤纸在紫外光灯下显示紫色，用铅笔定位，剪下相应的部位，进行洗脱，在特定波长下测定供试品的吸收度，按其吸收系数可计算出某一核苷酸的含量。 取本品，精密称定，加水制成每1ml中约含10mg的溶液，照中国药典附录纸电泳法测定。电泳毕，取出吹干，置紫外光灯（254nm）下检视，用铅笔划出跑在滤纸最前面的紫色斑点，剪下供试品斑点和与斑点面积相近的空白滤纸并剪成细条，分别放入试管中，精密加入0.01mol／L盐酸液5ml，搅匀，放置1H，待纸纤维全部下沉，倾取上清液，照分光光度法，在257士1nm波长处测定吸收度，减去滤纸空白吸收度的平均值，按C的吸收系数（E）为263计算含量。