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以上结果也可如下证实，考察用、、、和的氨基酸衍生物的分离行为，如下表所示： 如所预期，随着烃基侧链增长，其保留时间也增长，判定能力也增强；而的氨基酸衍生物则显示了相反的洗脱顺序。 本机理有一缺陷，即明确地评价两个功能基团的疏水性是有困难的，可以考虑用氨基酸衍生物保留时间的顺序来解释洗脱顺序。因为在氨基酸中α－是一个常见的功能基团，而一个氨基酸的衍生物的疏水性也决定于该氨基酸的侧链，因此，氨基酸的和洗脱顺序间的关系已如所示。 如所示，具有常规洗脱顺序（ ）的和氨基酸衍生物的要比侧链疏水性与α－相当的氨基酸衍生物的长，例如丝氨酸和天冬氨酸。 另一方面，具有相反洗脱顺序的氨基酸衍生物具有相对较短的平均保留时间。 于是，目标氨基酸的洗脱顺序可以用和氨基酸衍生物的平均保留时间进行解释。丝氨酸和天冬酰胺衍生物可被看作临界样品，它们的平均保留时间位于洗脱顺序的临界点上。 然而，鸟氨酸的二取代衍生物表现出非常有趣的分离行为，它们的洗脱顺序是相反的，尽管它们有相对较长的保留时间（），如所示。对这种分离行为的研究正在进行之中。 至此，第一个问题已基本得到解决。 由于氨基酸与所得衍生物的热不稳定性和低疏水性，致使它们对分析的敏感性很差。于是，选择电喷雾离子化和作为接口，并发展用 (氟，二硝基苯基)亮氨酰胺，即取代: (氟，二硝基苯基)丙氨酰胺，作为衍生化试剂，以便将法和质谱联系起来。 法与质谱的联用 在法中，氨基酸的衍生物由常规的反相分离并在处检测；在本法中，检测器被换成质谱仪，即氨基酸衍生物经分析。 为了顺利地将传统的条件改为适合分析的条件，必须解决如下两个问题： （）将从洗脱出来的液体注入质谱仪时，其体积应大大减小，因为和是最终被作为一种接口来使用的。 （）流动相中的非挥发性缓冲液应用挥发性缓冲液代替。 解决方法： （）应用半微量柱（× ,），本法用该柱给予和氨基酸衍生物以足够的分离度。若为 溶液流速应进一步减小至μ。 （）使用或醋酸铵缓冲液（＝）作为流动相，与使用磷酸缓冲溶剂系统有几乎相同的分离度。 尝试了种用于分析氨基酸衍生物的接口，即、大气压化学离子化（）、、和。极性氨基酸衍生物不能用和作为接口。 尽管任何氨基酸都可以用和接口，但它们的灵敏度特别低，这可能是由于氨基酸的衍生物的热不稳定性和低疏水性造成的，表明需要制备一种高疏水性的衍生化试剂。此外， 和被选作接口，还因为使用这种接口可以抑制温度诱导效应。 在中，疏水性越强的化合物其分离效果越好。 衍生化过程 引入了一个外消旋化程序，使用代替传统的化学外消旋化，以得到或氨基酸相应的对映异构体。 为了获得满足以下条件的衍生化试剂： （）可获得更高疏水性的氨基酸衍生物； （）不减少以前衍生物的特征吸收； （）符合通常所言的分离机制。 法与质谱联用技术及其应用 版权归属：百度文库账户拜水 目 录 前言 决定氨基酸绝对构型的原理 . 法分离机制的探讨 . 法与质谱的联用 . 衍生化过程 小 结 应 用 举 例 前 言 常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种： （）化学转变法； （）旋光比较法； （）旋光谱（）和圆二色光谱（）； （）单晶－射线衍射法； （）核磁共振法； （） 法与质谱联用。 目前酶法和法已用于决定氨基酸的绝对构型，但这些都是直接的方法， 确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。 另一方面，色谱方法例如和已经代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的。 年，发明了一种用来决定氨基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：通过手性试剂进行衍生化，将和氨基酸用分离成对映异构体。 于是引入手性试剂（（氟，二硝基苯基）丙氨酰胺，(，) ），被命名为试剂。 氨基酸与试剂反应所得衍生物用常用的进行分离，并在 处进行检测。氨基酸衍生物常常先于对应的氨基酸衍生物从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高的灵敏度。 因此， 法广泛用于肽类化合物的结构确证，证实肽类合成中的外消旋作用。 但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。 常见的试剂如下所示： : (氟，二硝基苯基)丙氨酰胺 : ……………..……………缬氨酰胺 : ……………..……………苯丙氨酰胺 : ……………..……………异亮氨酰胺