毕业论文：Pfu酶的表达，纯化及功能分析.docVIP

PAGE l Pfu酶的表达，纯化及其功能分析 （湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石 435002） 摘要：目的：利用重组大肠杆菌DH5α表达pfu酶，并对其功能进行分析。方法：含pfu DNA 聚合酶基因的重组大肠杆菌DH5α。经1mM IPTG诱导表达10-12小时后,用超声波破壁，再用用80℃,30min热变性去除部分杂蛋白,粗酶液经Ni离子亲和层析进一步纯化。最后用PCR检验酶的活性。结果：获得了高纯度的重组pfu 酶,并发现其具有较高的活性，利用该酶成功扩增出VHB的DNA 片段。 关键词： pfu DNA 聚合酶；IPTG诱导；纯化；活性。 Expression ,purification and function research of pfu DNA polymerase Ren Jia Tutor: Wang Youru (College of Life Science , Hubei Normal University,Huangshi,Hubei Province )) Abstact: Aim：Express pfu DNA polymerase in E. Coli DH5α，then purify it and research its function .Method: E. Coli DH5α containing pfu DNA polymerases gene ,10-12h after 1mM IPTG addition ,were wall-broken by ultrasonic wave. The extraction were purified by heat treatment (80℃，30min to denature E. Coli proteins), followed by metal-affinity chromatography on Ni2+-Sepharose columns. Conclude: We got pfu DNA polymerase after purification, then found that the enzymes were characterized and displayed high DNA polymerase activity. We use it successfully in amplification of VHB gene. Keywords：Pfu DNA polymerases； IPTG addition；Purification；Activity. Pfu DNA聚合酶是从超高温古生菌强烈炽热球菌 ( Pyrococcus furiosus)中分离得到的，拥有 3′→5′外切酶活性 ,这使它在 PCR扩增过程中能够校正错误 ,是已知 DNA聚合酶中出错率最低的 ,特别适用于需要高保真度的 PCR扩增[1]，被认为有潜力取代目前广泛使用的Taq酶。Pyrococcus fuiosus最早是在意大利Vulcano地热海底沉淀物中发现的。Pfu DNA聚合酶基因编码一个775个氨基酸的多肽 ,分子量 90 ,109D。这种酶最初是直接从 Pyrococcus fuiosus中分离得到的,但因这种极端嗜热的厌氧菌很难培养,难以获取大量的酶。本项目通过修饰引物使Pfu基因末端引入His-tag编码序列，从已有Pfu基因的载体上把它克隆下来，重新连接入更易表达的pET-28a载体中，并在大肠杆菌DH5α中大量表达，通过纯化使其与商用Pfu酶活性相当并对其功能做具体研究，发现其具有较高的活性。 目 录 1. TOC \o 1-3 \u 前言 1 2 材料与方法 2 2.1 材料 2 2.1.1 实验材料 2 2.1.2 仪器设备 2 2.1.3 试剂及溶液 3 2.2 方法 7 2.2.1 Pfu酶的表达…………………………………………………….7 2.2.2 目的蛋白的纯化 10 3 结果与分析 h 13 3.1 SDS电泳结果分析 14 3.2 PCR结果分析 14 4 讨论 h 16 5 总结…………………………………………………………………………..16 5.1 纯化过程中可能出现的问题…………………………………………17 5.2 PCR过程中可能出现的问题 17 6 参考文献 17 致谢 h 18 l Pfu酶的表达，纯化及其功能分析 任佳 指导老师：王友如 （湖北师范学院生命科学学院，生物科学1001班，湖北，黄石 435002） 1.前言. Pfu最初是直接从Pyrococcusfuriosus中提取出来的[2] [3]