类黄酮生物合成相关基因的克隆、载体构建及互作蛋白分析-园艺学专业毕业论文.docxVIP

研究生优秀毕业论文 类黄酮生物合成相关基因的克隆、载体构建及互作蛋白分析目录 类黄酮生物合成相关基因的克隆、载体构建及互作蛋白分析 目录 摘要 ．．i Abstract ． ．ii 缩略语表 ．．iv 第一章文献综述 ．1 1类黄酮化合物 1 2 MYB转录因子概述 ．．2 3类黄酮生物合成相关基因 2 3．1 CPC基因简介 3 3．2类黄酮生物合成结构基因 4 3．2．1花青素生物合成相关酶基因 ．4 3．2．2黄酮醇生物合成相关酶基因 ．7 3．2．3原花青素生物合成相关酶基因 ．7 4酵母双杂交系统 7 4．1酵母双杂交的原理 7 4．2酵母双杂交的应用 8 5 RNA干扰研究进展 9 6研究的目的和意义 ．10 7研究技术路线_ ．．11 第二章酵母双杂交筛选与CPC蛋白互作蛋白 ．．12 1引言 ．12 2材料 ．12 2．1菌株与载体 ．．12 2．2实验试剂 ．．12 2．3培养基 ．．13 3实验方法 ．14 3．1 AtCPC基因酵母双杂交诱饵载体的构建 14 3．1．1引物设计及AtCPC基因的克隆 ．．14 万方数据 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文3．1．2片段回收及连接克隆载体 华中农业大学2015届硕士研究生学位论文 3．1．2片段回收及连接克隆载体 14 3．1．3克隆载体转化大肠杆菌并筛选阳性克隆 15 3．1．4质粒提取 15 3．1．5质粒双酶切及目的条带的回收 1 5 3．1．6诱饵载体连接及热激转化大肠杆菌 16 3．1．7阳性克隆的筛选及质粒双酶切检测 16 3．1．8重组质粒转化酵母Y187 ．16 3．1．9自激活检测 17 3．2酵母双杂交筛选与CPC蛋白互作蛋白 18 3．2．1文库酵母AHl09与诱饵酵母Y187杂交 一18 3．2．2菌株的收集与初步筛选 18 3．2．3测序结果分析 1 8 3．2．4 X—a—gal显色反应 ．．19 4结果与分析 ．19 4．1 AtCPC基因的克隆 19 4．2重组质粒双酶切验证 一19 4．3重组质粒转化酵母Y1 87 20 4．4自激活检测 一21 4．5酵母双杂交筛选与CPC蛋白互作蛋白 21 4．5．1菌落PCR初步筛选 ．21 4．5．2测序结果分析 22 4．5．3 X-仅一gal显色反应 一22 5讨{念 ．23 5．1 AtCPC基因酵母双杂交诱饵载体的构建 23 5．2酵母双杂交筛选与CPC蛋白互作蛋白 23 第三章类黄酮生物合成相关基因的载体构建 25 1引言 ．25 2材料 ．25 3实验方法 ．26 3．1类黄酮生物合成相关基因超量表达载体的构建 一26 万方数据 类黄酮生物合成相关基因的克隆、载体构建及互作蛋白分析3．1．1玫瑰花蕾总RNA的提取、纯化及反转录 类黄酮生物合成相关基因的克隆、载体构建及互作蛋白分析 3．1．1玫瑰花蕾总RNA的提取、纯化及反转录 ．26 3．1．2引物设计及类黄酮生物合成相关结构基因克隆 26 3．1．3双酶切及目的片段的回收 26 3．1．4表达载体连接及热激大肠杆菌 27 3．1．5阳性克隆的筛选及双酶切验证 27 3．1．6重组质粒转化农杆菌EHAl05并筛选鉴定 27 3．2类黄酮生物合成相关基因干涉载体的构建 ．．27 3．2．1 NtLAR和NtANS基因amiRNA载体的构建 27 3．2．2 Gateway法构建NtFLS和Nt(LAR+ANR)基因RNAi载体 29 4结果与分析 ．30 4．1类黄酮生物合成相关基因超量表达载体的构建 ．．30 4．1．1类黄酮生物合成相关基因的克隆 30 4．1．2超量表达载体的构建和酶切检测 30 4．1．3重组质粒转化农杆菌EHAl05 32 4．2 NtLAR和NtANS基因amiRNA载体的构建 ．．32 4．2．1重组质粒双酶切检测 32 4．2．2重组质粒转化农杆菌EHAl05 33 4．3 Gateway法构建NtFLS和Nt(LAR+ANR)基因RNAi载体 ．．34 4．3．1重组质粒双酶切检测 34 4．3．2 LR反应阳性克隆的鉴定 ．．35 1；讨论． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ．． ．． ． ． ． ．． ．． ．．． ． ． ．． 36 5．1基因序列的选择 ．．36 5．2载体构建 ．．36 第四章前景展望 38 参考文献 ．39 附录 ．．47 致谢 ．．52 III 万方数据 类黄酮生物合成相关基因的克隆、载体构建及互作蛋白分析摘要 类黄酮生物合成相关基因的克隆、载体构建及互作蛋白分析 摘要 玫瑰(Rosa rugosa)为蔷薇科蔷薇属观赏灌木，花型优美，气味芬芳，色彩艳 丽。玫瑰特有的花色、花香和抗逆性让其在园林绿化和工业生产等方面有着很高的 应用价值。矮牵牛(Pe