温州医学院药学院生物技术制药课件第四章 动物细胞工程制药（2）.ppt

第三节 动物细胞的培养 一、动物细胞的营养要求 环境适应力最差，培养时间长，营养要求高 培养特点： （1）碳源为葡萄糖 （2）氮源为氨基酸 （3）添加小牛血清和动物胚胎浸出液 二、动物细胞的培养条件 1.温度 哺乳动物细胞最佳温度：37±0.5℃ 昆虫细胞最佳温度：27℃ 2.pH 细胞培养最适pH：7.2-7.4 低于6.8或高于pH7.6→细胞退变或死亡 加入缓冲系统：保持培养环境的pH稳定 培养时空气，CO2等进行PH调节 酚红做指示剂 3.氧 5% CO2的混合气体 4.防止污染：十分重要 培养时间长，培养基营养丰富 小牛血清的支原体污染 解决： 严格灭菌 抗生素：青霉素，链霉素，卡那霉素等 三、动物细胞的培养基 1.平衡盐溶液(balance saline solution, BSS) 生理平衡盐溶液，与生理的PH，渗透压等一致。 用于洗涤细胞 常用的有Hanks液，Earle液，HEPES溶液等 2.合成细胞培养基(sythetic) 1950年，Morgen第一个合成培养基：199培养基 已经商品化的基本合成培养基有199、MEM、RPIM 1640、DMEM等 优点：成分明确，组分稳定，可大量生产 基本组分 基本培养基包括四大类物质： 氨基酸；维生素；碳水化合物；无机盐 氨基酸 至少含有上述13种氨基酸——Eagle MEM培养基 最多含21种氨基酸——199培养基 12种必需氨基酸:缬、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸(L型) 谷氨酰胺(glutamine)： 缺乏可导致细胞生长不良甚至死亡。在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50% 维生素 脂溶性维生素：(A、D、E、K)常从血清中得到补充。 水溶性维生素：包括生物素、叶酸、烟酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、 吡哆醛、偏多酸钙、核黄素(B2) 、硫胺素(B1) B12、Vc、胆碱、肌醇和对氨基苯甲酸。 3.天然培养基(nature medium) 动物体液或组织提取成分做培养液 血清最为常用 ：牛血清、马血清、兔血清 胎牛血清：取自剖腹产的胎牛；胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 新生牛血清：取自出生24小时之内的新生牛； 小牛血清：取自出生10－30天的小牛 维持液 生长液 目前重点开发的无血清培养基 是在基本合成培养基上加入起血清作用的各种激素和多肽生长因子 如转铁蛋白，胰岛素，氢化可的松等 动物培养基采用膜过滤法灭菌 四、动物细胞的基本技术 （一）细胞的原代培养 （1）剪碎：无菌的解剖刀和剪子把组织切成小片 （2）胰蛋白酶或胶原酶进行消化酶解： （3）分散的细胞清洗纯化后，计数和接种，37 ℃培养 原代培养材料来自于胚胎及成体的组织和器官 胚胎组织生命力强，细胞间粘连弱，易于消化分解，易于培养和繁殖 成体组织相反 肿瘤细胞繁殖力强，可在体外长期培养繁殖，并可进行悬浮培养 组织快培养法：组织切成小块，培养。在组织块周围长出新的细胞单层。 单层细胞培养法：组织中的细胞用酶消化成单个细胞，制成细胞悬液，培养 （二）细胞的传代培养 细胞的传代(subculture)：从原培养容器中分离细胞 操作过程（贴壁细胞）： 1.弃使用过的细胞培养基 2.清洗：使用PBS平衡盐溶液清洗细胞。 3.消化：加入消化液(trypsin)到长着细胞的一面。 孵育在5-15分钟，仔细监测细胞分离过程，避免细胞受损伤。 4.吹打：当细胞变圆、离开培养皿底部时， 加入培养基，通过移液管在细胞表面反复吹打分散细胞。计数并再次培养细胞 （三）细胞的克隆培养 克隆培养(clonal culture)：即单细胞分离培养，由单细胞培养成纯细胞系 一般用饲养细胞 如杂交瘤细胞的筛选和培养 五、细胞的大规模培养 在人工条件下在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。 20世纪60-70年代，就已创立了可用于大规模培养动物细胞的微载体培养系统和中空纤维细胞培养技术。 是目前生物高科技药物大规模生产的核心技术 （一）动物细胞的大规模培养方法 大规模培养三种培养方法: 悬浮培养：CHO细胞(中华仓鼠卵巢)、BHK-21细胞(仓鼠肾)，杂交瘤细胞，昆虫细胞等进行悬浮培养 贴壁培养：人二倍体细胞、 传代细胞Vero细胞(非洲绿猴肾)等利用载体进行贴壁培养 固定化培养(贴壁-悬浮培养) 1. 悬浮培养 是指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程，是细菌发酵基础上改进的 主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等,也适用于兼性贴壁细胞 气升式，搅拌式反应器 生产重组蛋白和单抗 ２.微载体培养 60-250um的颗粒，创造大面积供细胞贴附生长 载体体积小，比重轻，在轻度