沙眼衣原体CT703蛋白在感染细胞中的表达及功能初探-医学免疫学专业毕业论文.docx

原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：拉 日期：逊年—翻4日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 本课题受如下基金资助：国家自然科学基金： 本课题受如下基金资助： 国家自然科学基金： 沙眼衣原体基因CT259在持续感染时的表达变化及功能初探 (NO 湖南省自然科学基金： 沙眼衣原体感染后细胞蛋白质磷酸化分析(N0：08JJ3061) 中南大学研究生教育创新工程： 沙眼衣原体基因CT703的表达及功能研究 (NO：2960．7113 1100061) 中南大学博士学位论文 中南大学博士学位论文 中文摘要 摘要 一、研究目的 1．研究CT703蛋白在沙眼衣原体感染细胞中的表达模式、持续性 感染状态下CT703蛋白的表达变化。 2．研究CT703蛋白对Ra们旺班IⅨ信号通路的激活及抗凋亡作 用。 二、研究方法 1．ImPCR法扩增沙眼衣原体L2血清型CT703基因全长序列并 亚克隆到原核表达质粒pGEX．6p．1中。 2．IPTG诱导重组质粒pGEX．6p．1／CT703在大肠杆菌BL21中表 达相应的重组融合蛋白，利用SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化 重组融合蛋白，以纯化的重组融合蛋白作为免疫原免疫小鼠制备抗 CT703蛋白多克隆抗体。 3．采用W．estem Blot和免疫荧光技术，以抗CT703蛋白多克隆抗 体为一抗检测CT703蛋白在沙眼衣原体急性感染状态下的表达模式。 4．采用R正PCR和W色stem Blot技术分别检测在干扰素吖诱导沙 眼衣原体持续性感染状态下CT703mIⅢA和蛋白水平表达变化。 5．构建CT703基因真核表达重组质粒pcDNA4／CT703并转染 HeLa细胞，W．estem Blot技术检测CT703蛋白是否活化Ra价征舳IⅨ 信号通路；并检测转染细胞在十字孢碱(Staurosporine，STS)作用 下，细胞凋亡率以及Caspase．3活性变化。 三、研究结果 1．利用RT-PCR技术扩增沙眼衣原体L2血清型CT703基因，扩 I 中南大学博士学位论文 中南大学博士学位论文 中文摘要 增片段长度约1．5kb，与预期理论值大小一致。重组质粒 pGEX-6p．1／CT703经出I和ⅣDf I双酶切后，约在1．5kb处同样出 现特异性DNA条带。通过DNA测序，证实插入的基因序列与 GeIlBank公布的CT703基因序列完全一致，表明重组质粒构建成功。 2．原核表达重组质粒pGEX．6p．1／CT703经IPTG在大肠杆菌BL2 l 中诱导表达，纯化产物经考马斯亮蓝染色显示产物分子量约8 1kDa， 由55KDa的CT703蛋白和26KDa的GST蛋白组成，与预期理论的 分子量大小一致。以抗GST蛋白抗体为一抗，W．eStem Blot技术检测 纯化的重组融合蛋白，在81I①a处检测到相应的蛋白条带。W．erstem Blot实验证实以重组融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能与CT703蛋 白特异性结合；间接ELISA法检测抗血清效价，结果显示抗体滴度 最高达到l：32000。 3．利用W．estem Blot技术检测CT703蛋白在沙眼衣原体急性感染 状态下的表达，感染后24小时可检测到相应的蛋白，随着感染时间 的延长，蛋白表达量逐渐增多，并持续存在于整个感染过程，未感染 细胞组没有检测到CT703蛋白的表达；通过免疫荧光技术检测CT703 蛋白表达，最早在感染12小时即可检测到相应的蛋白。在干扰素．y 诱导沙眼衣原体持续性感染状态下，RT-PCR和W-estem Blot技术检 测CT703 mI矾A和蛋白的表达情况，结果表明持续性感染状态下 CT703 mRNA和蛋白表