三株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白原核表达及免疫原性差异性研究-预防兽医学专业论文.docxVIP

PAGE PAGE III Prokaryotic expression and immunogenicity of recombinant AnkA protein of 3 isolates Annnnaaaappppllllaaaassssmmmmaaaapppphhhhaaaaggggooooccccyyyyttttoooopppphhhhiiiilllluuuummmm A Dissertation Submitted to Shihezi University In Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Agriculture By Yao Na (Preventive Veterinary Medicine) Dissertation Supervisor: Prof. Chen Chuangfu Prof. Zhang Lijuan May, 2013 PAGE PAGE IV PAGE PAGE VI 摘要 嗜吞噬细胞无形体（Anaplasmaphagocytophilum）属于立克次体目无形体科无形体 属，是一类直径为 0.2-1.0um 的经蜱传播的严格细胞内寄生的革兰氏阴性菌，主要引起 人粒细胞无形体病（Human Granulocytic Anaplasmosis，HGA）。自 20 世纪 90 年代初于 美国首次发现以来，澳洲、欧洲多国、韩国及我国先后均有报道，且近年来呈上升趋势。 2006 年安徽芜湖弋矶山医院的人粒细胞无形体病院内传播感染事件是我国第一次报道 的人粒细胞无形体病感染确诊病例，也是世界范围内首次报导的人粒细胞无形体人传人 事件。由于该病的临床多表现为急性不明原因发热，肌肉痛，乏力，头痛等类似病毒感 染性疾病症状，临床缺乏对该病的足够认识，也缺乏相应的快速诊断方法，因此该病及 易发生误诊，严重时可导致多器官功能衰竭，甚至死亡。 为探索人源无形体不同分离株 AnkA 蛋白免疫原性是否存在差异，进一步揭示这些 蛋白质间可能存在结构及免疫表位差异以及可能相关的与宿主细胞作用蛋白谱差异。首 先利用 DNAMAN 软件比对美国 Webster 株、斯洛文尼亚 1567 株和美国 96HE58 株人源 无形体分离株 AnkA 蛋白氨基酸序列，结果发现三株菌 AnkA 蛋白的一致性为 90.2%， Webster 株与 96HE58 株 AnkA 蛋白的一致性最高，为 95.2%，1567 株和 96HE58 株 AnkA 蛋白的一致性最低，为 90.6%。对这三株无形体 AnkA 蛋白 B 淋巴细胞线性表位预测分 析发现 Webster 株和 96HE58 株人分离株无形体 AnkA 蛋白抗原表位存在一个差异，而 它们与 1567 株 AnkA 蛋白抗原表位预测结果差异较大。 我们对3株无形体不同ankA基因进行了原核表达，同时进行了免疫原性初步分析。 利用PCR技术扩增了嗜吞噬细胞无形体Webster株，斯洛文尼亚1567株，美国96HE58株 ankA基因部分序列，构建pET-30a-AnkA表达载体，转化至大肠杆菌BL21中，以IPTG诱 导高效表达融合蛋白，经飞行质谱鉴定氨基酸序列，免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 采用ELISA和Western blot方法分析三株菌AnkA重组蛋白与免疫小鼠血清抗体相互间， 以及与10种常见的立克次体目成员阳性抗体鼠血清间的免疫反应。同时检测三株菌 AnkA重组蛋白与我国无形体病人血清抗体反应性。结果表明表达的重组蛋白主要以可 溶性形式存在，小鼠免疫获得高效价抗AnkA IgG抗体，三株菌重组蛋白免疫抗体之间存 在免疫交叉性，与立克次体目成员间存在免疫交叉性。三株菌重组蛋白与我国无形体病 人血清抗体存在免疫反应。 本研究成功原核表达并纯化了三株嗜吞噬细胞无形体AnkA蛋白，重组蛋白与我国 无形体病人阳性血清存在免疫反应。三株嗜吞噬细胞无形体AnkA重组蛋白与免疫小鼠 多克隆抗体之间存在交叉反应，通过Western blot和ELISA方法得到人源无形体不同分离 株AnkA蛋白质之间的免疫原性差异不显著，表明它们之间的空间结构及其相似，抗原 表位差异较小；通过与立克次体目成员免疫反应存在免疫交叉反应表明该重组蛋白无较 好的特异性，不适合应用于鉴别诊断。 关键词：嗜吞噬细胞无形体；AnkA 蛋白；原核表达；免疫原性；交叉反应性 V VII Abstract Anaplasma phagocytophilum is a 0.2-1.0um Gram-negative bacteria,which is a tick-borne a