影响微生物生长之因子.DOC

間接計數法 1.前言 間接計數法是將待測樣品(例如:飲用水、廢汙水、食品等)予以培養計數，較常用的方法為平板計數法，將一定體積的待測水樣，經過稀釋後，以塗碟或倒碟在平板計數培養基培養24個小時，由於微生物細胞可以長成一個菌落，在稀釋倍數知道的情況下，計算培養基上生成的菌落數目，便可知水樣中存活細菌的數目。 2.目的 本次實驗可以學習如何利用平板計數法進行待測水樣微生物的計數，並學習採樣與稀釋菌液濃度的方法與技巧。 3.步驟: 1.間接計數法主要以塗碟和倒碟為主 2將酵母菌稀釋至10-5 倍 3.再用稀釋之酵母菌液進行吸光值檢測 4.【倒碟法】 (1)先配置培養基，以高溫高壓滅菌釜進行滅菌，等待培養基溫度較為降低時(培養基尚未凝固)，進行倒碟 (2)倒碟時，由稀釋菌液取0.1mL，充分混合後倒入空的培養皿中 (3)等待凝固時，放入37。C培養箱培養，隔天觀察並計算菌數 5.【塗碟法】 (1)將菌液先行稀釋(連續10倍稀釋)10-1，10-2，10-3，10-4，10-5 再取0.1mL(固定量)，滴於已準備好培養皿正中央 (2)三角彎棒浸於酒精溶液中，取出再以燃燒法將酒精燃盡，降溫後才可塗碟 (3)塗碟時，用三角彎棒將菌液均勻塗抹在培養基上 (4)放在37℃培養箱培養，觀察及計算菌數一般以30~300個菌為主 (5)將菌數回推原液菌/mL，必要時取平均值±標準偏差 設備: 【間接計數器材】 培養皿*5 含培養基培養皿*5 三角彎棒 酒精燈 安全吸球 定量玻璃吸管 隔熱手套 燒杯 錐形瓶 玻璃瓶 試管架 【間接計數儀器】 恆溫培養箱 高溫高壓滅菌釜 UV-vis spectrophotometer 【微生物分離藥品及採樣來源】 豐富培養基 酵母菌 二段水 3.結果: 【倒碟法】 10-1 菌落數為150 原菌液體:150*10*10=1.5*104/mL 10-2 菌落數為81 原菌液體:81*102*10=8.1*104/mL 10-3 菌落數為9 原菌液體:9*103*10=9*104/mL 10-4 菌落數為8 原菌液體:8*104*10=8*105/mL 10-5 菌落數為5 原菌液體:5*105*10=5*106/mL 平均值:Xbar =(1.5*104+8.1*104+9*104+8*105+5*106 )/5=11.9*105 標準差:σ={[(1.5*104-11.9*105)2+(8.1*104-11.9*105)2+(9*104-11.9*105)2+(8*105- 11.9*105)2+(5*106-11.9*105)2]/5}1/2=19.2*105 【塗碟法】 10-1 菌落數為無法計算 10-2菌落數為無法計算 10-3 菌落數為無法計算 10-4 菌落數為無法計算 10-5 菌落數為無法計算 【吸光度】 稀釋倍數 吸光度 原液 1.67 稀釋10-1 0.62 稀釋10-2 0.06 稀釋10-3 0.01 稀釋10-4 0.004 稀釋10-5 0.002 4.問題: Q1：說明10mL之菌液如何配置成稀釋10-2倍與10-3倍之稀釋菌液。 Ans: 取1mL之菌液加入9mL的二段水，稀釋為10-1 再從稀釋為10-1裡取1mL再加入9mL的二段水，就稀釋為10-2 再從稀釋為10-2裡取1mL再加入9mL的二段水，就稀釋成為10-3 Q2：實驗所得知總生菌數是否能真正代表樣品中的微生物數量?為什麼? Ans: 不行 那只能算是大略估算而已，不可能完全跟樣品中的微生物數量一模一樣，一定多少都會和總生菌數的數量上產生差別。 Q3：為什麼進行平板計數法時，我們以0.2mL菌液進行塗抹，而不直接採用1mL進行試驗？ Ans: 如果使用1mL進行塗抹會導致菌落數過多，因而造成無法計算，用0.2mL就會相對減少，比較不易出現菌數過多的現象，造成無法計數菌落數為多少。 Q4：平板計數法進行計數時，其計數原則為何?? Ans: (1)培養皿若有擴散菌落產生，且超過培養皿1/2時應該不予計算。 (2)培養皿被擴散菌落抑制之菌落，超過培養皿1/4時應該不予計數。 (3)擴散菌落為一條鏈狀時，視為一個菌落。兩條以上且生長起源不同時，每一條鏈狀視為一個菌落，若起源相同則僅視為一個菌落。 (4)同一培養皿若由兩個人各計數一次，其差異不得超過10%，若由同一人計數兩次以上，其差異不得超過5%。 圖表： 吸光度 倒碟法 討論： 這次實驗很不理想，雖然使用分光光度計測時沒有出現負值，但是塗碟法實在是無法計算，可能培養基或實驗的過程中感染，不然就是菌液過多產生菌數無法計算，倒碟法則是很難掌控溫度，因為培養基放置過久，會導致整個培養基凝固，