利用特异性S2-R2引物鉴定动物组织、人石蜡切片和临床皮损中的孢子丝菌-皮肤性病学专业毕业论文.docxVIP

学位论文版权使用授权书本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连医科大学有关保留、使 用学位论文的规定，同意大连医科大学保留并向国家有关部门或机构 送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 大连医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论 文。 论文作者签名： 至查： 指导教师签名：壹l塑 签字Et期：j丑年上月垒日 独创 独创 性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究．[ 作及取得的研究成果。据我所知，除厂文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得大连医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： ；寺、 签字}，t期： 且年上月旦曰 利用特异性S2一R2引物鉴定动物组织、人石蜡切片和临床皮损中的孢子丝菌 利用特异性S2一R2引物鉴定动物组织、人石蜡切片和临 床皮损中的孢子丝菌 硕士研究生： 王 东 指导教师： 刘晓明教授 专业名称： 皮肤病与性病学 摘 要 申克氏孢子丝菌是孢子丝菌病的致病菌，主要引起皮肤，皮下组织 和附近淋巴系统的亚急性和慢性感染，偶尔可以播散至骨骼和内脏，甚 至诱发全身的播散性感染。本病在我国东北较为多发，可在流行区成批 发生，危害人民健康。目前该病的诊断较为困难。真菌培养，不仅耗时 (约一周)，且阳性率不高；组织病理为非特异性肉芽肿性炎症，组织内 病原学诊断仍只限于HE和PAS染色，但因菌量少，常规组织学方法很 难发现。近年来，学者们在该病的诊断研究中进行了多方面的探索，包 括血清学检测、免疫荧光抗体、免疫病理及电镜技术。血清学检测因特 异性问题而未能延续；免疫荧光抗体与免疫病理技术的应用，虽然提高 了诊断速度，却因抗体不易标准化、病理存在非特异染色等问题而限制 其应用；电镜由于操作复杂，视野小很难发现病原菌而无法推广。我们 课题组曾以50株不同地区来源的孢子丝菌临床分离株及标准株的基因 组DNA作为研究样本，以毛霉、烟曲霉、念珠茵临床分离菌株基因组 DNA作为对照，通过特异引物PCR扩增的方法筛选国内外文献中报道 的4对孢子丝菌引物S2．R2、SSHF3 1．SSHR97、ITS3．SSP、SS3一SS4结 果表明针对几丁质合成酶基因I的引物S2．R2最特异且敏感。 目的：本研究将以感染孢子丝菌的动物模型为研究样本，进一步对 4对引物进行筛选，并将获得的特异而又敏感的引物用于石蜡切片及临 床活检标本的孢子丝菌检测，以达到从基因水平对孢子丝菌病进行准确、 快速诊断的目的，为尽早治疗提供依据，也可减少因误诊误治而造成的 损失。 材料和方法：(1)l 2只小鼠随机分成试验及对照组，实验组皮内注 射孢子丝菌菌悬液，并于不同时间留取皮损组织，分别进行真菌培养和 皮损组织DNA提取，PCR扩增。比较不同引物的敏感性和特异性。(2) 取30例大连及l 0例长春地区临床疑诊孢子丝菌病、组织病理示感染性 肉芽肿的石蜡切片标本，采用改良的微波脱蜡、液氮研磨．CTAB破壁法 肉芽肿的石蜡切片标本，采用改良的微波脱蜡、液氮研磨．CTAB破壁法 提取孢子丝菌DNA，以我们筛选获得的孢子丝菌特异而又敏感的S2．R2 引物进行PCR扩增，扩增产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察， 与真菌培养的结果进行比对。(3)1 0例临床疑诊孢子丝茵病患者，在病 理活检时获取O．4×0．8CM2皮损，平分皮损组织分别用于传统的真菌学 鉴定(真菌培养，组织病理)及PCR检测。皮损经钝刀去除杂质后匀浆， 离心取下层沉淀，以微量提取法(液氮研磨．．CTAB法)提取其中的真菌 DNA，以特异性S2一R2作为引物，进行PCR扩增，产物于1％琼脂糖凝 胶中电泳，紫外灯下观察。 结果：1．4对引物S2一R2，SSHF3 l-SSHR97，ITS3．SSP，SS3．SS4在感 染孢子丝菌的小鼠皮损中均可扩增出目的条带，但引物SSHF3 1．SSHR97 所需浓度较高，与在体外培养条件下筛试的结果相同，引物S2．R2为最 敏感和特异的引物。 2．30例初诊疑是孢子丝菌病的石蜡标本中PCR扩增阳性为22例， 阳性率为73．33％。真菌培养阳性为22例。在22例真菌培养阳性的标本 中有20例PCR出现阳性条带，阳性率为9 l％。8例真菌培养为阴性的标 本中有2例PCR出现阳性条带，阳性率为25％。1 0例长春地区的标本 中PCR阳性为7例，阳性率为70％。毛霉、烟曲霉、念珠菌病石蜡切片 各l例的PC