三株霍乱弧菌基因组文库的构建与鉴定及含ctxΦ阳性克隆子的筛选-内科学(消化系病学)专业论文.docx

郑州人学博十学位论文 郑州人学博十学位论文 三株霍乱弧菌基因组文库的七勾建与鉴定及含clx中刚性克隆子的筛选 三株霍乱弧菌基因组文库的构建与鉴定及含ctx阳性 克隆子的筛选 博士研究生 谢婧 导 师 段广才 郑州大学公共卫生学院 郑州450052 论文摘要 研究背景 霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是我国传染病防治法 中规定的甲类传染病，也是国际检疫的传染病之一。目前根据O抗原的不同，已 经有206个血清型，但在1992年以前，只有01群霍乱弧菌能引起霍乱的流行和 爆发。1992年lO月，在印度和盂加拉国出现了一个新的血清群一0139群(vc0139) 的大流行，并暂时性地取代了占流行优势的0l血清群，并很快造成全球范围的流 行，引起了全球学者的广泛关注。 VC 0139是近几年出现的新的血清型霍乱弧菌，其生存能力比E1Tor型霍乱弧 菌(EVC)强，一些学者提出VC 0139将会引起第八次霍乱的世界大流行。越来 越多的学者致力于研究这种新型的霍乱弧菌的米源，为霍乱的预防和控制及霍乱疫 苗的研制提供理论依据。目前关于VC 0139的来源主要有三种观点：～种观点认 为VC0139是由EVC突变而来的。VC0139与EVC相比，除菌体抗原与EVC存 在差异外，具有很多的相同或相似之处：(1)相同或相似的毒力因子、毒力基因及 其调控系统(2)相同大小的限制性内切酶片段(3)电泳分析相似的电泳型(4) CTX遗传单元的数目及其在染色体中的位置基本相同(5)主要毒力基因高度同源 郑州大学博士学位论文 郑州大学博士学位论文 三株霍乱弧菌基因纽文库的构建与鉴定及含c1)西阳性克隆子的筛选 的保守序列(6)相同的定居因子TCP及其调控系统。这些都提示VC 0139可能 是EVC的O抗原突变型，是EVC获得了部分菌体抗原基因同时又丢失一些基因 而变异的结果。另～种观点认为VC 0139是由非01群菌株获得了EVC的毒力基 因而来的，因为VC 0139具有非Ol群霍乱弧菌的某些特征：如VC 0139具有的 荚膜结构、部分VC 0139还携带有质粒等。有学者甚至提出VC 0139本来就存在 于环境中，由于一些有利条件的变化使它们成为优势克隆群而造成霍乱的流行。 由于霍乱弧菌毒力相关基因总是成簇地位于染色体上，而且一般都在几kb至 几十kb之间，难以用一般的PCR法扩增并克隆这些基因，这给霍乱弧菌的研究带 来了不便。因此到目前为止，VC 0139的来源还不清楚，导致VC 0139的出现的 因素也仍然是一个谜，虽然近几年来各国学者对VC 0139已进行了大量的研究， 并取得了一定的成果，但对于其来源问题，但到目前为止，VC 0139的来源还不清 楚，还需做大量的工作。 我国1993年在新疆某地首次爆发了由VC 0139引起的霍乱，虽然目前主要由 EVC引起霍乱流行，VC 0139主要引起散发，但VC 0139引起的病例有逐年增加 的趋势。很多学者对我国新疆1993年分离的VC 0139的分子生物学特征进行了研 究，结果表明新疆分离的0139菌株与印度和孟加拉国分离的0139菌株有较小的 差异，不属于同一基因型，但这也不能排除该菌株为输入性菌株的可能。 研究目的 为了更进一步了解我国新疆分离的VC 0139菌株的分子生物学特征 及其来源，本研究拟选用可以插入大片段DNA的粘粒SuperCOSl为载体，构建新 疆0139群菌株XJ93006、国际0139群标准株M045的基因组文库：选用pNEBl93 质粒为载体，尝试插入较大的DNA片段，建立新疆EJ Tor型霍乱弧菌菌株89079 的基因组文库，并对三个菌株的基因组文库的质量和实用性作了评价：P,---@基N 组文库中筛选出霍乱弧菌的主要毒力基因簇ctxqb的阳性克隆子，并对其迸行分析： NNENTN疆E1 Tor霍乱弧菌的肠毒素基因(ctxAB)及其启动子序列。本研究 为研究我国VC 0139的来源及构建霍乱的疫苗奠定坚实的基础。 实验方法 1．粘粒基因组文库的构建：用SDS裂解、酚氯仿抽提的方法提取霍乱弧菌的基因 组DNA。基因组DNA经Sau3AI部分酶切大小为30 kb～40 kb或20 kb左右的 郑州火学博十学位论文 郑州火学博十学位论文 二株霍乱弧菌基因纽文库的构建与鉴定及含clx西m性克隆子的筛选 片段。部分酶切的DNA片段用碱性磷酸酶(CIAP)进行去磷酸化。30 kb～40 kb的DNA片段与经XbaI线性化、ClAP去磷酸化、BamHl酶切的SuperCOSl 的载体臂相连接，连接产物用X噬菌体包装蛋白混合物体外包装为九噬菌体颗 粒，九噬菌体颗粒转染大肠杆菌XL--Blue MR，利用氨苄抗性筛选阳性克隆， 并以混合池的方式保存该基因组文库。