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分子生物学参考题答案 请简述实时定量PCR的过程和基本原理。 原理：具体实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。 过程：1.在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质 2.随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等 比例增加。 3.经过一个循环，收集一个荧光强度信号 4.通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线 图。 三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。 请简述蛋白质生物合成的三个主要过程。 氨基酸的活化：氨基酸必须在氨酰-tRNA合成酶作用下生成活化氨基酸 AA-tRNA。 氨基酰tRNA的形成是一个两步反应过程 氨基酸与ATP作用，形成氨基酰腺嘌呤核苷酸； 氨酰基转移到tRNA的3-OH端上，形成氨酰tRNA 二、肽链的起始、伸长和终止 （1）翻译的起始： 1.蛋白质合成的起始需要核糖体大、小亚基，起始tRNA和几十个蛋白因子的参与， 2.在模板mRNA编码区5’端形成核糖体-mRNA-起始tRNA复合物 3.将甲酰甲硫氨酸放入核糖体P位点。 （2）翻译的伸长：肽链的延伸有许多循环组成，每加上一个氨基酸就是一个循环，每个循环包括进位、成肽和移位。 （3）翻译的终止： 1.当mRNA上终止密码出现后，没有相应的AA-tRNA与之结合 2.而释放因子（RF）能识别终止密码子并结合，水解P位上多肽链和tRNA之间二硫键。 3.多肽链合成停止，肽链从核糖体中释出，mRNA、核蛋白体等分离 新合成多肽链的折叠和加工： 新生成的肽链大多数是没有功能的，必须经过加工修饰才能转变为有活性的蛋白质。 N端fMet/Met的切除、二硫键的形成、特定氨基酸的修饰（磷酸化、糖基化和甲基化）和切除新生肽链的非功能片段 3、请简述酵母双杂交技术实验原理。 1.巧妙利用真核生物转录调控因子的组件式结构 2这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）是转录激活因子发挥功能所必须的。 3.BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。 4、请简述免疫共沉淀技术的实验原理和主要步骤。 实验原理： 这一技术的核心是通过抗体来特异性识别候选蛋白 如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一种蛋白也会被沉淀 主要步骤： 将靶蛋白的抗体通过亲和反应连接到固体基质上 再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系 用低离心沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白质复合物沉淀到试管底部或微膜上 请论述真核生物与原核生物在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面的异同点。 1）在真核细胞中，成熟mRNA为单顺反子mRNA，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。 2）真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。 3）高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间存在不被翻译的内含子。 4）真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。 5）在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于转录起始位点上游不远处，在真核生物中，基因转录的调节区则大得多 6）真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质。原核生物中不存在这样严格的空间间隔。 7）许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能被顺利地翻译成蛋白质。 6、请简述核小体的组成和结构特征。 组成: 核小体是由H2A、H2B、H3、H4各两个分子生成的八聚体和由大约200bpDNA组成的。 结构：1.串珠样结构 2.DNA盘绕组蛋白八聚体核心，从而使分子收缩成1/7。 3.核心颗粒包括组蛋白八聚体及与其结合的146bp DNA，该序列绕在八聚体外面1.75圈。 请简述真核基因组独特的结构特点。 （1）真核基因组结构庞大 （2）基因的转录产物为单顺反子 （3）真核基因组含有大量重复序列 （4）真核基因中存在非编码序列和间隔区（断裂基因），故具有不连续性 （5）真核基因组存在大量的顺式作用元件 （6）真核基因组有端粒结构 8、请简述DNA的半保留复制及其生物学意义。 1.DNA生物合成时母链解开为两股单链，各自作为模板