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Ch6 生物酶工程 生物酶工程（Biological Enzyme Engineering）： 是指在基因水平上，对酶蛋白分子进行修饰、改造，改进酶蛋白的催化特性或酶蛋白的蛋白质特性等。 本章主要介绍 核酶、进化酶、杂合酶和抗体酶的有关基本概念和基本知识。 Ch6-1 核酶(Ribozyme) 到目前为止，除了我们传统概念的酶——蛋白质外，还发现另一类具有催化活性的物质——核酸。 这里的核酶要和核酸酶（Nuclease）的概念区别开来，前者是酶的化学本质是核酸；后者是指催化核酸水解的酶，其化学本质是蛋白质； 1981年Cech等发现四膜虫的核糖体前体RNA可以在没有酶蛋白存在的情况下，自身催化切除内涵子，完成加工过程；发现了具有催化活性的RNA，从而提出了核酶这个概念。 由于核酶具有很多与酶蛋白截然不同的特点，尤其在医学界的优势更为突出，用于基因治疗可以克服一直困扰人们的免疫问题。所以近些年来引起了酶工程研究领域的极大热情。 Ch6-2 酶分子的定向进化（Directed Evilution） 酶分子的定向进化是指在分子水平上，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），对酶基因进行改造，并进行定向选择，筛选出所需性质的酶蛋白。 对酶蛋白分子的改造，主要包括两个方面，即酶分子改造的合理化设计（Rational Design）和非合理设计（Irrational Design） 合理化设计：主要指事先已经搞清楚了酶蛋白的结构，有明确的修饰目标，定点改造某一结构活某氨基酸而设计的改造修饰方案，如酶蛋白的化学修饰、酶蛋白基因的定点突变等； 非合理设计： 事先不必确定基因的改造修饰目标，设计酶蛋白基因改造技术和方法，设计基因改造方案，然后按照预定目标要求，进行筛选。酶分子的定向进化就属于非合理设计。 Ch6-2 酶分子的定向进化（Directed Evilution） DNA改组技术 DNA改组技术是在易错PCR方法基础上发展起来的，设想经过易错PCR获得的两个或两个以上的正突变的突变体，如果将这些正突变的突变部位整合到一个突变体上，会获得更为突出的定向进化效果。 具体方法是将多个正突变的突变体混合，然后用脱氧核糖核酸酶Ⅰ进行随机切割，得到随机DNA片段，然后进行PCR扩增，此时随机DNA片段互为模版（Template）或引物（Primer），直到获得全长基因片段后，进行分离和筛选，以获得高效突变体。 Ch6-3 酶基因的定点突变 定点突变是对已知序列的基因(或DNA)中任意指定位置进行突变的技术，它又可以分为寡核苷酸诱导和寡核苷酸置换两大类。分别适用于不同类型的预先确定突变氨基酸位置的突变实验。 Ch6-3 酶基因的定点突变1.寡聚核苷酸诱导的定点突变 这项技术主要是利用带有预定突变序列的寡核苷酸单链引物，在体外与原基因序列退火，诱导合成少量完整的突变基因，然后，通过体内增殖得到大量的突变基因。这类技术的最早应用是Hutehison和Razill等人，分别用合成的寡核苷酸引物诱导了φX174单链噬菌体DNA嘌吟点突变。后来，逐渐改用M13单链噬菌体DNA作为基因载体，突变技术也日趋成熟。 Ch6-3 酶基因的定点突变2.寡聚核苷酸置换的定点突变 寡核苷酸诱导的定点突变法，只适用于将蛋白质中的某一氨基酸，转变为预定的另一种氨基酸。但如果事先不能确定转变产物，需将每一种可能代替的氨基酸逐一实验的时候，就要同时进行某一位点的多种突变。适合这类要求的突变方法，就是寡核苷酸置换的定点突变法。 这类方法的特点是，用带有各种所需突变序列的寡核苷酸，在体外直接置换目的基因中欲变部位而实现突变。因为是直接置换，所以不需要进行退火和诱导合成。然而置换过程需要限制性酶切和连接酶连接，所以必须在双链DNA之间进行。寡核苷酸是双链，目的基因及其载体(质粒或 Phage M13)也是双链。 Ch6-4 杂合酶 1. 杂合酶定义： 杂合酶（hybrid enzyme）：又可翻译成杂交酶。 杂合酶是由两种以上酶成分构成的，把来自不同酶分子中的结构单元（单个功能基团、或功能域）、或是整个酶分子进行组合或交换而产生的具有所需要的酶性质的优化杂合体。这一点和酶家族基因的同源重组有些类似。 杂合酶的获得包括非合理设计方法（通过构建基因库进行杂交重组，然后定向筛选）；合理设计方法（对操作对象的结构和功能研究详尽后，有目标地克隆基因片段进行重组）。 Ch6-抗体酶 抗体酶（Abzyme）： 指在抗体的易变区赋予酶催化活性后免疫球蛋白，又叫催化抗体（Catalytic Antibody） 最初是Schtlltz等人(1986年)和L