磷酸二酯酶亚型在血管外膜成纤维细胞中的表达和功能研究-内科学(心血管)专业论文.docxVIP

上海交通大学 上海交通大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：闩；参、觏 El期：j，口汐年牛月弓。Et 上海交通大学学位论文版权使用授权书 上海交通大学 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存和汇编本学位论文。 保密日，在廿解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 (请在以上方框内打“√”) 一躲骨匆旋 ≯宅乙， 日期：j的r年牛月；·El Et ll习：c,2 u湃幺月歹胡 目 目 录 中文摘要 1 英文摘要 5 缩略词表 9 引 言 ．．10 第一部分：PDE亚型在血管外膜成纤维细胞的表达 前 言： 14 材料和方法： 15 结 果： 25 讨 论： 31 第二部分：PDElA在血管外膜成纤维细胞表型转化中的作用 前 言： 33 材料和方法： 34 结 果： 4l 讨 论： 51 第三部分：PDElA在血管外膜成纤维细胞胶原表达中的作用 前 言： 54 材料和方法： 55 结 果： 57 讨 论： 62 结 论： ．65 参考文献： ．66 致 谢： ．76 投寄文章： ．78 附 录： ．79 上海交通人学医学院博I：论文磷酸二酯酶亚型在血管外膜成纤维细胞的表达和功能研究 上海交通人学医学院博I：论文 磷酸二酯酶亚型在血管外膜成纤维细胞的表达和功能研究 摘要 【研究背景】环核苷酸依赖的磷酸二酯酶(Cyclic nucleotide—dependent phosphodiesterase，PDE)是一超家族酶系，包括1 1种 亚型50多种基因型，主要功能是水解细胞内第二信使cGMP和cAMP， 后者在调节细胞的生长、增殖、细胞表型转化、血管张力及细胞外基质 表达等功能中发挥重要作用。既往对于PDE的研究多集中于肺成纤维细 胞、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)和内皮细胞等。 研究表明干预PDE2、PDE3和PDE4的功能可以抑制内皮细胞和平滑肌 细胞生长、迁移、基质表达。在血管方面，研究较多的是PDElA亚型， 它参与了VSMC增殖、凋亡、表型转化和血管张力的调节。近年来血管 外膜在血管重塑中的作用日益受到重视。我们以前的研究发现转化生长 因子131(transforming growth factor beta 1，TGF一131)可以诱导血管外膜成 纤维细胞(adventitial fibroblast，AF)向肌成纤维细胞(myofibroblast， MF)转化，后者的标志是胞浆中出现0【平滑肌肌动蛋白(alpha．smooth muscle actin，0【．SM actin)，蛋白激酶Ca(PKCa)信号涉及这一分化过 程。PDElA属于钙调蛋白(Ca2+／Camodulin，Ca2+／CAM)超家族，水解 上海交通人学医学院博上论文 上海交通人学医学院博上论文 cGMP的作用远远强于水解c脚。有研究表明PDElA阳性细胞在球囊 损伤的血管外膜表达显著增加；我们也发现PDE 1 A mRNA在VAF表达 较高，且是PDEl亚型主要的同工酶。但PDE亚型是否能够调节VAF 的功能以及PDElA的作用如何，目前尚无报道。 【目的】观察18种PDE亚型在VAF中的基因表达谱，研究PDElA 在VAF表型转化和胶原表达调节中的作用。 【方法】贴壁法培养SD(Sprague Dawley rat)大鼠胸主动脉VAF。 采用荧光实时定量逆转录PCR(Real Time RT．PCR)检测18种PDE亚 型mRNA的表达；DNA链末端合成终止法进行测序检验扩增产物与目 的基因序列的一致性。蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测细胞I型 胶原、PDElA、0L．SM actin(作为MF转化标志)及蛋白激酶Ca(PKCc‘) 蛋白的表达，同时免疫细胞化学技术检测O【．SM actin的表达。 【结果】 1．PDE亚型在VAF中的表达：实时定量逆转录PCR结果显示14种PDE 亚型mRNA在VAF表达。根据表达量高低，依次为PDE5A，PDElA， PDE8A，PDE4B，PDE4D，PDElC2，PDE3B，PD