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菌落总数测定 ——GB 4789.2-2010 磷酸盐缓冲液或生理盐水 ①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。 ②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。 ③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。 ④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。 混匀时可先顺时针旋转，再逆时针旋转，旋转中应防止混合物溅到平皿壁和皿盖上。 检样过程中应用稀释液做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿和吸管是否被污染。 检样过程中应在工作台内打开一块空白PCA（其暴露时间应与检样时间相当），以了解样品在检验操作过程中有无受到来自环境的污染。 检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min。 如果把不能立即计数，要将平板放入0～4℃冰箱中，但不能超过24 h。 菌落总数计数方法 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值。 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数。 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则对稀释度最低的平均菌落数进行计数。 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。 菌落总数计数方法 若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300CFU之间，则以最接近30或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 当有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围之内时，计算公式为： N——样品中菌落数； ∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； N1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数； N2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数； d——稀释因子（第一稀释度）。 霉菌和酵母菌计数 ——GB 4789.15-2010 稀释液为无菌水 霉菌和酵母菌的计数 选取菌落数在10-150CFU的平板进行计数。计算两个平板菌落数的平均值，再乘以相应稀释倍数计算。 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数。 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则对稀释度最低的平板计数。 若所有稀释度平板均无生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若为原液，则以小于1计数。 报告时以CFU/g或CFU/mL为单位分别报告霉菌和酵母菌数。 注意： 霉菌次生菌对检验结果的影响 霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，霉菌有着极强的繁殖能力，霉菌主要依靠产生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。孢子有点像植物的种子，不过数量特别多，特别小。 霉菌孢子多聚积成团。在吸取各稀释度的样液时，需要充分振摇或用吸管反复吹打，使孢子团分散开，并均匀混悬。 霉菌在适宜条件下生长迅速，先成熟的孢子落在培养皿上又可萌发长成新菌落，因此在培养的过程中观察，不要反复翻转平板，以免有次生菌形成而影响菌落计数的准确性。 大肠菌群计数 ——GB 4789.3-2010 大肠菌群指一群37℃、24h能发酵乳糖，产酸，产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。 大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是根据卫生学方面的需要设定的一类与粪便污染有关的一组细菌。 大肠菌群中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，是革兰阴性无芽孢杆菌，能在选择性培养基上产生典型菌落。 大肠菌群——MPN法 ——GB 4789.3-2010 MPN法注意事项 初发酵和证实试验： 初发酵和证实试验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“分解乳糖产酸产气”。 初发酵阳性管，并不确定就是大肠菌群阳性，经证实试验后可能成为阴性。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。 产气量与倒管： 在乳糖发酵试验中，有时小倒管内会有极微小的气泡，有时可以看到经初发酵培养后沿管壁有缓缓上浮的小气泡。可轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生。 在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生，复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时导管内无气体，但在液面及管壁却可看到小气泡。导管管口的完整情况与导管外有无沉渣存在均可影响产气反应的观察，管口不完整性有利于气体进入导管，管口周围有沉渣能阻碍或延缓气体进入。 MPN检索表只给了三个稀释度，如改用其他稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。 灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法 **原因一：过早打开灭菌锅 分析：当灭菌锅压力表示数为0，而温度还高于室温时，不要打开灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降