第一章 沉淀与共沉淀(3课时).pptVIP

有机溶剂沉淀的影响因素 ① 温度：多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。  ②样品浓度：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。 反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。 ③ pH值：有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。  ④ 离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。 以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果， 通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。 有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离， 使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH值和离子强度，使之达到最佳的分离效果。 沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量， 如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性 选择性变性沉淀法 这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目标物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。 常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。 热变性 利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目标生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。 此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。 表面活性剂和有机溶剂变性 不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目标物仍留在溶液中。 使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性 选择性酸碱变性 利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤 等电点沉淀法 等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。 氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出。 因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。 此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目标物 有机聚合物沉淀法 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。 其中应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量。 在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。 PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH和温度等因素的影响。 在一定的pH值下，盐浓度越高，所需PEG时浓度越低，溶液的pH越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG的浓度越低。在一定范围内，高分子量和浓度高的PEG沉淀的效率高。 以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有： ①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。 ②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。 ③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。 ④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。 本方法的优点是： ①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。 ③沉淀后有机聚合物容易去除。 （一）混晶共沉