第四章 酶的分子修饰.pptVIP

Chapter 4 Modification of Enzyme Molecule 第四章 酶的分子修饰 酶分子修饰的目的 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。 三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。 酶分子修饰的设计 一、充分认识酶分子的特性，包括酶的—— 1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性 二、 修饰剂的选择，要考虑—— 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量） 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团） 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件 三、反应条件的选择，要注意—— 1. 酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间 4.1 酶分子主链修饰 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。 4.2.1 常见基团的化学修饰反应：氨基 4.2.2 常见基团的化学修饰反应：羧基 4.2.3 常见基团的化学修饰反应：巯基 4.2.4 常见基团的化学修饰反应：胍基 4.2.5 常见基团的化学修饰反应：酚基 4.2.6 常见基团的化学修饰反应：咪唑基 4.2.7 常见基团的化学修饰反应：吲哚基 大分子修饰的作用 （1）提高酶活力（空间构象改变） 一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为原来的2.25倍。 一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高原来的 5.1倍。 一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高0.30倍 （2）增加酶的稳定性 水溶性大分子结合法修饰SOD可使其在体内的稳定性提高, 半衰期延长70—300倍 修饰酶热稳定性也可显著提高，且具较强的抗蛋白酶水解，抗酸碱及抗氧化的能力。 例： L-天冬酰胺酶：用聚丙氨酸结合修饰后，热稳定性提高。 木瓜蛋白酶 + 右旋糖苷：显著增强酶抗酸碱，抗氧化能力。 0 30 51 MPEG2-E 28 51 64 MPEG1-E 底物保护的修饰酶 0 11 52 MPEG2-E 27 16 66 MPEG1-E 无底物保护的修饰酶 100 100 0 天然酶 抗原-抗体结合能力/% 酶活/% -NH2修饰 样 品 （3）降低抗原抗体反应 利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原性。 4.3 酶的组成单位置换修饰 氨基酸置换修饰 核苷酸置换修饰 置换修饰的方法： （1）化学修饰方法 难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。 （2）定点突变技术（ site directed mutagenesis ） 为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。 Site-directed mutagenesis CAG GTC CAG GCC CAG GCC CAG + polymerase + primer replication GCC CGG Mutant Thr translation Wild type GTC CAG Val translation Only one amino acid changed Wild type protein Mutant protein primer (1) (2) (3) (5) (4) (6) Val → Thr Smith (1993) 改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。 4.4 金属离子置换修饰 活性降低甚至丧失 活性升高、稳定性增加 只适用于在分子结构中本来含有金属离子的酶 ！ * * 1、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验， 半衰期短、易变性失活； 2、酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求，限制了酶制剂的应用范围； 3