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过氧化氢酶活力的测定实验报告 　　幻灯片1　　实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定　　——高锰酸钾滴定法　　幻灯片2　　一、实验目的　　?1.掌握过氧化氢酶活力测定的方法　　?2.了解过氧化氢酶在生物体中的作用原理?3.掌握测定酶米氏常数的基本原理和方法　　幻灯片3　　二、实验原理　　?过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，　　铁起传递电子的作用，过氧化氢既是氧化剂又是还原剂。?R(Fe2+)+H2O2=R(Fe3++OH－)　　?R(Fe3+OH－)2+H2O2=R(Fe2+)2+2H2O+O2　　?总反应式：2H2O22H2O+O2　　过氧化氢酶　　幻灯片4　　?据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。　　?本次实验酶促反应速度用单位时间底物的减少量表示，求出单位时间内反应前后H2O2　　的量，计算出酶促反应速度。　　?在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。　　?5H2O2+2KMnO4+4H2SO4=5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4　　幻灯片5　　底物浓度对酶促反应速度的影响　　?在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。　　?底物浓度很低时，酶促反应的速度随底物浓度的增加迅速增加；随着底物浓度继　　续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到一定值时，反应速度达到极限值。　　?米氏方程表示底物浓度与反应速度的关系　　幻灯片6米氏常数Km　　?Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。　　?在酶学分析中，Km是酶的一个基本特征常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。　　?Km表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。　　?对于每一个酶促反应，在一定条件下都有其特定的Km值，因此可用于鉴别酶。　　问题：如何测定酶的Km值?　　幻灯片7　　?米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法?如下：　　?[S]为底物浓度?v为反应速度　　?vmax为最大反应速度　　?Km为米氏常数　　?用双倒数法计算Km和vmax　　Km11??vvmax[S]vmax　　幻灯片8　　三、材料、试剂与器具1.材料：新鲜马铃薯2.试剂：　　1）10%H2SO4　　2）/L磷酸缓冲液,　　3）/L高锰酸钾标准液：称取，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，临用前用草酸钠标定。幻灯片9　　高锰酸钾溶液标定　　?取5mL/L的草酸和3mL10%H2SO4溶液于锥形瓶中，加热至℃　　，趁热用KMnO4标准溶液滴定，刚开始反应较慢，滴入一滴KMnO4标准溶液摇动，待溶液褪色，再加第二滴KMnO4。随着反应速度的加快，滴定速度也可逐渐加快，但滴定中始终不能过快，，不断摇动或搅拌。滴定至溶液呈现微红色并持续半分钟不褪色即为终点。　　?离子反应方程式：2MnO4-+5C2O42-+16H+←→2Mn2++10CO2+8H20计算公式：标定的KMnO4C=/Vmol/L幻灯片10　　4）/LH2O2：市售30%H2O2大约等于/L，取30%H2O2溶液，稀释至1000mL，用标准mol/LKMnO4溶液进行标定。　　5）/L草酸钠：称取优级纯Na2C2O4，用蒸馏水溶解后，定容至1L。　　幻灯片113.器具　　恒温水浴　　研钵　　三角瓶酸式滴定管容量瓶幻灯片12四、实验步骤　　?酶液提取　　取新鲜马铃薯5g加入的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至50mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将缓冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。　　注意：提酶在0－4℃操作　　幻灯片13　　?酶活力的测定?1.反应　　?取50mL三角瓶4个，测定瓶中加入酶液，对照瓶中加　　入煮死酶液，再加入/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO4。　　?2.滴定　　用/LKMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色为终点。　　注意：每瓶反应时间要精确控制在10min　　幻灯片143.计算　　?酶活力用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示?酶活(mgH2O2/g·min)=?式中：　　?A—对照KMnO4滴定毫升数；　　?B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；?VT—酶液总量；　　?V1—反应所用酶液量；?FW—样品鲜重；　　—1mL/L的KMnO4相当于H2O2　　幻灯片15　　动力学常数的测定1.反应　　?取100mL锥形瓶5个，编号后按下表加入试剂