第四节基因工程的基本技术3dna序列分析资料.pptVIP

Chapter Four基因工程的基础知识与基本技术 第三节 DNA序列分析 Sanger双脱氧链终止法 Maxam-Gilbert化学裂解法 测序的常用方法 Sanger双脱氧链终止法(chain-terminator method) 1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性, 设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法, 进行DNA序列测定,即双脱氧链终止法 因Sanger法测定了碱基序列, 获得1980年诺贝尔化学奖 (注：1958年因用酶法测得人胰岛素的氨基酸排序而得诺奖) 1.Sanger双脱氧链终止法原理 基本原理： 聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子； 利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP 3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。 2 具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反