临床产ESBLs大肠埃希菌的耐药特性及基因分型的研究-内科学专业论文.docxVIP

临床产ESBLs大肠埃希甍的耐药特性及基因分型的研究 临床产ESBLs大肠埃希甍的耐药特性及基因分型的研究 摘要 裔的：研究稳床分离的产超广谱§一内酰胶酶(extended spectrum §lactamases，ESBLs)大肠埃希精耐药特点以期指导临床用药，应惩聚会 酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)对大肠埃希茵产生的ESBLs 进行初步分型。方法；1．纸片扩散法(Kirby-Bauer，l(_B法)：采用美国 全国临床捡验标准委员会(the National Comlittee for clinical Laboratory Standards，NCCLs)推荐的该方法测定订株大肠埃希蘸对14 种抗菌药物的耐药饿。该实验方法要点：将待测细菌制备成与0．5麦氏标 准管波度福瞬的菌液，并把它均匀涂布予灭菌昀耩ueller-Hinton培养基表 面，干燥数分钟，耀无菌镊将含蠢氨苄鞭捧、豢啶酸、嚷挝鳆棒、庆大蒜 索、环丙沙星、左氧氟沙星、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻膊、头孢他啶、 阿米卡星、氮曲南、头孢吡肟、驻胺培南等药物的纸片分别平贴予舻H培 养基表蘑，簿强纸嚣阕距离不少予24激，纸片孛心疆离乎蘧边缘不少予 15础。将贴蠢药片的平皿鬣于35C孵辅，孵育18 h质，用毫米尺测量抑 菌环直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，抑菌环赢径的 大小簸映了测试细菌对测定药物的敏感程度。判断标准参照2004年NCCLS 规定，每次试验均用大脑埃希菌标准蓥株ATCC25922进行凄拄。2．初步筛 选试验(screening test)：按标准纸片法的规定进行接种，将头弛他啶、 头孢嚷肟、氨曲南和头孢曲松四种抗生索纸片均匀地贴子平板上，35(3孵 育18 h蜃，溅量各瓣蓥匿整径，擐据粼糙200矗标准，懿莱头孢德啶≤22 mm，头孢噻脬或氨曲南≤27硼，或头孢曲松《25 mm，提示这些菌株为可 疑ESBLs产生株。3．纸片确认试验(confirmatory test)：按标准纸片法 的规定进行接种，受试菌株同时用将头孢他啶、头孢他啶／克拉维酸的纸煞 的规定进行接种，受试菌株同时用将头孢他啶、头孢他啶／克拉维酸的纸煞 和头孢噻熙、头孢噻肟／竟拉维酸魄纸片均匀堍贴·予孚扳上，3S℃孵育18 h 屠，分别测量各撺菌罄盘径，对两令串镊何一个药物，翔克拉维酸后掷菌 霞蠢径与不翔竞拉维酸酌榔蓠圈相比，增大值≥5戳时，初步判定为产 ESBLs。4．双纸片协同试验(．double disc synergy test，DDST)：挑取 在盘平板上生长的细菌茵落，用无菌生理盐水稀释成m 5麦氏比浊标准浓 度的菌液。无菌棉签蘸取适量菌渡均匀涂布予M吨平板。待稍千詹，申央 贴上阿莫酉捧／竟拉维酸纸冀，然后在距该纸篾25疆处(中心一书心)分 别羹占上头憨选松、头孢饱啶、头孢噻肟和氨麴南药敏纸片作为指示帮，35 ℃孵育18 h观察结架。若指示剂在朝商褥莫语林／克拉维酸方向有撺菌圈 扩大的现象(协同现象)，则说明待检菌产生超广谱B一内酰胺酶。5．PCR 扩增：采用UNICP-IO柱式质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA，各标本分别 使用T1：5’-GTGTCGCCCTTATTCCC-3’，T2：5’—cATAGTTGTTGCcTGAcTCCC 一3’及S1：5’一TGTATTATCTCCCTGTTAGC-3’，S2：5’一TTAGCGTTGCCAGTGCTC 一3’两对引物扩增blaTEM及blaSHV，扩增片段长度分别为785 bp和848 bp。反应体系：引物各2 m，25 mmol／L氯化镁8 pl，10 mmol／L dNTP 2 弘l，lOXbufferlO蛆，5U／¨1 Taq DNA聚合酶0．5沮，质粒DNA模板2 p1， 补充去离子水73．5恤l至总体积100 I-q。每株细菌的模板均用TEld引物及 SHY引物分别进行扩增，总反应体积为i00肛l。反应参数为94℃预变性3 min 后开始循环，94C变性1 min，56C退火l min，72C延伸l min，总共为 32个循环，最后72。C延伸10 min。扩增时以大肠埃希菌ATCC25922作阴 性对照，产TE妒4和SHV一3标准菌株作阳性对照。用含0．5 mg／ml溴化乙 锭的1．5％琼脂糖凝胶置于电泳槽中，浸于0．5XTBE电泳液中，把PCR扩增 产物嵌次翻入琼脂糖凝胶齿魏中，调节电泳仅电嚣为100 产物嵌次翻入琼脂糖凝胶齿魏中，调节电泳仅电嚣为100 v，电泳60 min。 在波长为254 n越的紫外灯-F，DNA存在缝可觅橙黄色的荧光条带。如Elj TEM 或SIN引物扩增的产物有条带即认为该菌株含有T