狂犬病毒糖蛋白衍生肽引导双报告蛋白靶脑转运的研究-微生物与生化药学专业论文.docx

4．1．3主要试剂的配制 4．1．3主要试剂的配制 23 4．2试验方法 ．23 4．2．1给药方式 一23 4．2．2组织切片 一23 4．2．3显微观察 。23 4．3结果 24 4．3．1荧光检测EGFP ～24 4．3．2 X-ga I染色检测p-QAL ．29 4．4结论与分析 35 在校成绩 ．36 参考文献 ．．37 I跗录 43 致{射 ．．45 两南大学硕士学位论文 两南大学硕士学位论文 摘要 狂犬病毒糖蛋白衍生肽引导双报告蛋白 靶脑转运的研究 摘要 中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病，如老年痴呆症、帕金森病等 严重影响人们的生活质量，给社会、家庭带来沉重负担。将具有治疗作用的物质输送至 脑部、对脑部疾病进行有效地治疗，一直是人们期待的目标。然而，由于血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的存在，许多有潜在治疗价值的大分子物质难以进入脑内。将这 些大分子治疗物质透过BBB、靶向转运入脑，一直是人们不懈探索的目标。目前，开发 靶脑载体是解决这个难题的有效途径，将具有治疗功能的物质通过分子克隆的方法，与 靶脑载体连接，在细胞中表达形成融合蛋白，在载体的协助作用下，可实现大分子物质 的靶脑转运。 狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein， RVG)是一种嗜神经性的蛋白质， 能够携带其它物质向中枢神经系统转运、促进其他病毒转运到脑中，已证实位于第189～ 214位和第330～357位的肽段具有嗜神经性，这些肽段是RVG与受体结合的关键部位， 将这些肽段进行改造，可得到靶向中枢神经系统、无免疫原性的RVG衍生肽段 (RVG—derived peptide，RDP)，这种衍生肽保留了RVG的嗜神经性，具有将外源物质转 运入脑的潜在功能。 将189—214位与第330—327位多肽片段的基因序列进行改造，并分别命名为RDPl89 与RDP330，本实验室为了验证RDP的靶脑转运大分子蛋白的功能，将RDPl89和RDP330 的核苷酸片段与双报告基因egfp和lacz的核苷酸片段重组，用RDP携带大分子双报告 蛋白B一半乳糖苷酶(B—galactosidase，B-GAL)和增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)入脑转运，同时构建没有RDP序列的egfp和lacz 重组质粒，作为对照，探究RDP的入脑转运能力。 通过分子克隆方法，将载体RDP核苷酸序列与B—GAL和EGFP的核苷酸序列重组，获 得重组质粒pET28(+)一RDP—EGFP-LacZ，同时构建没有RDP的B—GAL和EGFP的核苷酸重组 质粒pET28(+)一EGFP—LacZ，作为对照。获得阳性克隆后，大肠杆菌体内，在25。C，6h， IPTG：1．Omi的条件下进行蛋白诱导表达，超声破碎的方法，获得目的蛋白，融合蛋白 均为可溶性表达，无须包涵体处理。Lorry法测定总蛋白含量，通过尾静脉注射方法注 射入小鼠体内。小鼠实验分为三组，实验组，注射有RDP引导的EGFP和B-GAL融合蛋白， 西南大学硕士学位论文 西南大学硕士学位论文 摘要 对照组，注射没有RDP引导的EGFP和B—GAL融合蛋白，空白组，不作处理。15min、8h后 分别处死小鼠，取组织，固定、脱水、切片，通过荧光显微镜和X—gal染色分别检i贝gEGFP 和B—GAL。实验结果显示，实验组，在大脑皮层的神经胶质细胞和海马区的神经元以及 脊髓灰质中，分别检测到蛋白的分布，外周组织中，除了肾脏和肝脏，其他外周组织蛋 白的分布与空白组相似；对照组，仅在肾脏和肝脏中检测到蛋白的分布，其他各组织蛋 白发布与空白组相似。另外，在实验组和对照组的肾脏和肝脏中均检测到蛋白的分布， 原因是这两个器官是主要的排泄和解毒器官，一部分蛋白可能通过这两个器官排泄排出 体外。此外，蛋白注射小鼠体内15min后，便能在脑部检测到蛋白的分布，并且含量较 高，说明转运速率非常快，提示融合蛋白转运的可能机制是通过受体介导的胞吞作用实 现的。8h后，在实验组基本上检测不到蛋白，说明蛋白已经被清除，RDP携带大分子蛋 白入脑后，可以被机体排除，不会长久残留在体内，为生物安全性提供实验依据。通过 以上的实验结果，可以得出RDP具有脑靶向性，有携带大分子蛋白透过BBB、转运入脑的 能力。本实验的意义在于为大分子蛋白质穿越BBB、靶脑转运提供一种安全有效的方法， 为其他功能性大分子治疗物质靶向治疗脑疾病提供了理论依据。 关键词：血脑屏障中枢神经系统狂犬病毒糖蛋白狂犬病毒糖蛋白衍生肽 H 西南大学硕十学位论文