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激光扫描共聚焦显微镜技术 The techniques of Confocal Laser Scanning Microscopy 基础医学研究所 王珺 激光扫描共聚焦显微镜技术 基本组成及原理 功能 荧光探针的选择 样品要求 在生物医学中的应用 激光器 半导体激光器：405nm 氩离子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm 氦氖绿激光器：543nm 氦氖红激光器：633nm 激光扫描共聚焦显微镜基本原理 检测针孔和照明针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 ? 高分辨率的光学切片 激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获得高标准的连续光学切片 ? 实现三维重建 LSCM的基本特点 观察方式：以荧光为主 光源：激光（紫外、可见光） 照明方式：点照明、逐点扫描 成像方式：共聚焦、逐点成像 输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析 多重染色样品的观察 基本功能 多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集 光学显微镜分辨率：0.25mm 共焦显微镜分辨率：0.18mm 基本功能 无损伤、连续光学切片，显微“CT” 三维重组 基本功能 定位、定量分析 基本功能 时间序列扫描: xyt 、xyzt 和 xt 扫描 感兴趣区域扫描 基本功能 图像处理功能 如对样品中很弱或很强的荧光信号进行增强或减弱、去噪、平滑、提取等操作，从而保证了图像高反差、高清晰度、定位准确。 荧光探针的选择 选择荧光探针的主要步骤： 1、根据实验目的确定需要检测的目标； 2、确定可供选择的荧光探针的范围； 3、考察荧光探针的特性是否符合荧光样品的制备要求； 4、荧光探针与所用共聚焦显微镜系统的匹配情况 几种常用的荧光探针 DNA和RNA检测 吖啶橙（AO）、碘化丙啶（PI），既可标记DNA又可标记RNA。 PI不能进入完整的细胞膜， 常用于检测膜损伤、细胞凋 亡、细胞核定位、核酸定量等。 激发波长536nm 发射波长617nm 几种常用的荧光探针 AO激发波长为492nm，发射波为分别为530/640nm。用激光共聚焦显微镜双通道观察可见：活细胞的胞核呈黄绿色荧光，胞质呈绿色荧光；死细胞呈红色荧光 AO 492/526 DNA 强结合方式 绿色荧光 492/650 RNA 弱结合方式 红色荧光 几种常用的荧光探针 Hoechst33342 Hoechst33258和DAPI，这三种都是DNA的特异性的荧光染料，细胞毒性小，特异性强。与DNA结合后都是以紫外光激发，发射明亮的蓝色荧光，分辨率高。 几种常用的荧光探针 Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞 Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活细胞 DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞 几种常用的荧光探针 蛋白质、酶、抗体及其他分子等的检测 FITC（异硫氰酸荧光素）能够结合细胞内总蛋白质，它是检测蛋白质最常用的荧光探针，它还能广泛地结合各种特异性的配体。用488nm的激光器激发后，发出明亮的绿色荧光。 光照下易淬灭，不易保存。 几种常用的荧光探针 另一种常用的共价标记物是罗丹明，其光稳定性比FITC好。其衍生物TRITC（四甲基异硫氰基罗丹明）是常用的共价标记探针，发红色荧光。 几种常用的荧光探针 绿色荧光蛋白（GFP） 已成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物。该蛋白吸收光的波长最高峰在395nm处，在479nm处也有吸收峰；发射的绿色荧光波长最高峰在509nm处，在540nm处伴随有一小峰。因此内源性荧光基团受到紫外光或蓝光激发时，均可发出绿色荧光。 几种常用的荧光探针 类似于绿色荧光蛋白，目前所使用的荧光蛋白还包括蓝色荧光蛋白（BFP），青色荧光蛋白（CFP）及黄色荧光蛋白(YFP)。 几种常用的荧光探针 细胞内游离钙离子 最常用的有Fluo-3、Fluo-4，能用可见激光（488nm）激