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激光共聚焦显微镜技术 吉林大学人兽共患病研究所 王心蕊 绪论 激光共聚焦显微镜技术（Confocal Lasers Scanning Miccruscope CLSM) CLSM是将显微镜技术与激光技术有效的结合，使用紫外或可见光激发荧光探针，对有荧光标记物的形态及功能，利用计算机进行成像，从而得到细胞或内部微细结构的荧光图像。它汇集了激光技术，显微镜技术，免疫荧光技术，计算机及图像处理技术，精密的机械技术等高，精，尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。 激光共聚焦显微镜发展史 激光共聚焦显微镜的特点 激光共聚焦显微镜是现今最为先进的光学显微镜，其主要优点为：以激光为光源，在相应的荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能，并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图像，并可以任意角度旋转，观察细胞，组织的立体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的Ca离子浓度和pH值等活细胞生理信息；可对细胞膜的流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等，可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术使得对活细胞和组织进行原位，动态，定量的观察和测量的梦想成为现实。 光学显微镜显微镜的基本原理 普通显微镜的基本结构和原理 荧光显微镜的基本结构和原理 激光共聚焦显微镜基本结构和原理 显微镜的基本结构 光学系统 机械装置 显微镜的基本结构 光学系统 （1）目镜 有一组透镜组成目镜，可以使物镜成倍地分辨、 放大物像，例如10X、15X等。 按照所能看到的视场大小目镜可分为：普通目镜；广角目镜两种 （2） 物镜 它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数，主要有10X、20X、 40X、 60X、100X等 （3）光源 有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。 （4）聚光器　包括聚光镜、孔径光阑。聚光镜由透镜组成，它可以集中透射过来的光线，使更多的光能集中到被观察的部位。孔径光阑可控制聚光器的通光范围，用以调节光的强度。 显微镜的基本结构 （1）机架 显微镜的主体部分，包括底座和弯臂。（2）目镜筒　位于机架上方，靠圆形燕尾槽与机架固定目镜插在其上。根据有否摄像功能，可分为双目镜筒和三目镜筒；根据瞳距的调节方式不同，可分为铰链式和平移式。（3 ）物镜转换器　它是一个旋转圆盘，上有3～5个孔，分别装有低倍或高倍物镜镜头。转动物镜转换器就可让不同倍率的物镜进入工作光路。（4）载物台　是放置玻片的平台，其中央具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹，用来夹住载玻片。右下方有移动手柄，使载物台面可在XY双方向进行移动。（5）调焦机构　利用调焦手轮可以驱动调焦机构，使载物台作粗调和微调的升降运动，从而使被观察物体对焦清晰成像。（6） 聚光器调节机构 聚光器安装在其上，调节螺旋可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱。 光学显微镜的分类 光学显微镜的分类光学显微镜有多种分类方法： 按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜； 按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜； 按观察对像可分为生物和金相显微镜等； 按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等； 按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等。 常用的显微镜有双目体视显微镜、金相显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜等。 荧光显微镜的基本结构和原理 荧光显微镜的构成 荧光显微镜的基本结构和原理 光源 激发滤片、双色反色镜、阻断滤片 物镜、目镜 荧光显微镜光源 汞灯光源: 提供激发光(U、V、B、G) 荧光激发块镜组 A激发滤色镜 C吸收滤色镜 B分光镜 荧光显微镜的分类 透射式：激发光来自被检物体的下方，聚光镜为暗视野聚光镜，使激发光不进入物镜，而使荧光进入物镜。它在低倍情况下明亮，而高倍则暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不使用于非透明的被检物体。 落射式：透射式目前几乎被淘汰，新型的荧光显微镜多为落射式，光源来自被检物体的上方，在光路中具有分光镜，所以对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。 荧光的性质 吸收光，必需有激发光源 荧光波长＞激发波长（损失热能） 荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的荧光衰减（光漂白） 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率 荧光显微镜的优点和用途 优点： 检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察——荧光素 荧光的有无、