霍乱弧菌检验操作规程.docVIP

PAGE PAGE 12 霍乱弧菌检验操作规程 范围 本操作规程规定了带菌者粪便，患者粪便、呕吐物、肛拭子，外环境水样，水生动物、食品等标本中的霍乱弧菌的检验方法。 检验依据 国家传染病诊断标准：WS 289—2008 卫生部疾病控制司《霍乱防治手册》第五版 北京市卫生防疫站《卫生防疫微生物检验操作规程》 《北京市常见传染病防制工作手册》 （北京市疾病预防控制中心传地所2008年12月内部资料） 设备和材料 冰箱： -20℃～4 恒温培养箱： 36±1℃ 暗视野显微镜： 10×～100×。 架盘药物天平： 0g～500g, 精确至0.5g。 锥形瓶： 100 mL、500 mL。 灭菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。 灭菌平皿： 直径90 mm。 灭菌试管：10 mm×75 mm、16 mm× 灭菌注射器： 1 mL。 载玻片。 盖玻片。 无菌棉签。 500mL灭菌采样瓶。 生物安全柜：Ⅱ级。 4 培养基和试剂 4.1 碱性蛋白胨水（Ph8.8-9.0 ， 10—15mL/管 ， 10× 50mL/瓶）。 4.2 庆大霉素琼脂（15-20 mL/块）。 4.3 普通营养琼脂（15-20 mL/块）。 4.4 半固体培养基（3mL/小管，5mL/中管 ）。 4.5 霍乱弧菌单克隆抗体(国家CDC流研所提供， 5—10μL/菌落)。 4.6 泰国S＆A诊断血清（5—10μL/菌落)。 5 检验程序 霍乱弧菌检验程序见图1。 6 标本的收集与送检 要求见表标准与要求（一）—（四） 7 操作步骤 7.1 快速辅助诊断：其结果只是初步报告，不是确诊报告。 7.1.1 7.1.1.1 如是急性期病人的水样便，则用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜 环放置生理盐水中研匀，盖上盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力；高度可疑的标本可取已增菌的碱性蛋白胨水1滴在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动（象夜空中的流星）即动力试验阳性，否则阴性。 7.1.1.2 动力试验阳性的标本，则取O1和O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各2滴放置玻片上，取标本1滴或1环放在其中研匀， 7.1.1.3 动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告，但不 7.2 分离培养 7.2.1 粪便、呕吐物和肛拭子：对急性期病人水样便标本在碱性蛋白胨水增菌培养的同时可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上；所有病人标本都应接种碱性蛋白胨水增菌培养。37℃增菌6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，把接种环在试管壁上轻轻碰一下，待接种环上留有残液后划线接种庆大霉素琼脂培养基，划线时接种环在基线处反复多次划线以接种的菌液干了为准，最后用接种环从基线处开始不间断划线到完成或四区划线（必须划出单个菌落）。37℃培养，18h-24h。必要时（高度可疑或密接服药的病人）可取第一次增菌液1 mL转种于8-10mL碱性胨水管中3 7.2.2 水体的采集一般用无菌的500mL水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内) 500mL，2～3小时内送检。取450mL水样，用1mol/L氢氧化钠调整至pH8.8-9.0。然后加 10倍浓缩碱性胨水50mL。为抑制杂菌可再加入1%亚碲酸钾0.25 mL和1000单位/ mL青霉素1 mL。37℃培养过夜划线接种庆大霉素琼脂培养基，接种划线方法同7.2.1。培养时把瓶盖打开三分之一。培养后取菌膜下表层培养物0.2-0.3 mL接转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h，再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃ 7.2.3 7.2.3.1 液体食品：同7 7.2.3.2 涂抹标本：使用无菌棉签涂抹3～5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔或食品等表面，直接接种到10 mL碱性蛋白胨水，37℃增菌培养8～12h划线培养。同时取菌膜下表层培养物接种庆大培养基分离培养同时吸0.2～0.1 mL转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养8～12h再划线接种庆大霉素琼脂培养基， 食品及水产品、物品表面涂抹涂样本表面涂拭物病人粪便标本 食品及水产品、物品表面涂抹涂样本表面涂拭物 病人粪便标本 水样、液体食品等标本 增菌３７℃ 增菌３７℃ 增菌３７℃ 8-12 增菌３７℃ 二次增菌３７℃6-8h 二次增菌３７℃ 二次增菌３７℃8-12 二次增菌３７℃ 动力试验 动力试验（+） 动力抑制试验（+） 庆大平皿划线培养３７℃