2016-0425-Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用.pptx

Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用;Content;基因操作技术一览;Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。 Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp, 编码343个氨基酸, 38kDa, 单体蛋白。 Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两个loxP位点间发生基因重组。 Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、环状甚至超螺旋DNA。 ;1.1 Cre-loxP技术基本原理;1.2 Cre-loxP技术应用;启动子;启动子;1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处;传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、费用也比较高。;均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰 ;2.1 CRISPR-Cas9技术来源;;1.??靶基因分析：明确CDS外显子部分； 2.??sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位